診斷業之窘|一項準確率在九成以上的成熟技術，為何在此次疫情中馬失前蹄？

（記者/韓璐編輯/陳曉平）

疫情洶洶，確診人數為千萬人關注。在關鍵區域的湖北，診斷標準中途則有調整！

2月初，《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第五版）》發布，國家衛健委將CT影像結果作為診斷標準（只限于湖北?。?，“疑似病例具有肺炎影像學特征者”，即為臨床診斷病例；2月中旬，公布的第六版方案規定，“具有肺炎影像學特征者”，作為疑似病例的判定標準。

湖北將CT臨床診斷病例數納入“確診”統計后，單日新增新冠肺炎病例一度過萬，大大加速了診斷的效率。CT影像技術的深度介入，卻使核酸檢測技術以及診斷業陷入尷尬。

假陰性感染者頻繁出現、檢測效率被指低下、試劑質量受質疑，很多人開始質疑核酸檢測技術臨床應用價值。中國醫學科學院院長王辰公開表示，“核酸對于真實病例的檢測率不過30%至50%”。

一項成熟的診斷技術，為何在此次疫情中馬失前蹄？診斷業緣何陷入20年來的又一次危機？

意外的質疑

診斷方案調整之前，核酸檢測是公認的確診標準。

中國科學院神經學科研究所研究員仇子龍告訴《21CBR》記者，病毒是一種攜帶遺傳信息的微生物，遺傳信息的儲存形式是核酸，核酸分為DNA和RNA，RNA是遺傳信息DNA轉變為蛋白質的中間態。

檢測到病毒的核酸，就能確認病毒存在?！皩τ谛鹿诓《镜拇_認，核酸檢測一定是確診標準，只有在呼吸道分泌物中發現核酸，才能確診患者?！背鹱育堈f。

金斯瑞生物科技提供了部分檢測試劑，其生命科學總裁邵煒慧表示，區分新型冠狀病毒感染和普通感冒，核酸檢測是相對快速準確的檢測手段，通用的是反轉錄定量熒光PCR檢測法，艾滋病、SARS也以此檢測。因為新冠病毒是單鏈RNA病毒，有一個逆轉錄過程，將原來的RNA病毒逆轉錄成為DNA鏈，就可進行PCR檢測。

那么，新病毒出現后，如何開發試劑？

首先要了解病毒，進行全基因組測序，獲得基因組序列，以新型冠狀病毒為例，試劑公司會將病毒的全基因組序列和人類的全基因組序列等對比，找出其獨特序列特征，作為檢測的靶向序列。

“病毒基因組一般在3萬個堿基左右，和人類30億個堿基相比，單鏈RNA病毒基因組不會太大。找到特異性序列后，再根據生物學分析，基于很難改變的生物特性，尋找到合適的參照序列?！鄙蹮樆劢忉?，金斯瑞此次交付的試劑，加入了體外合成的陽性參照質粒，作為實際合理性的關鍵判斷原料，可輔助判斷結果是否可靠。

“核酸檢測不是一項新技術，包括親子鑒定、核酸提取這類體外診斷，技術成熟，已有數十年商業實踐，病毒一旦序列確定，就可提供相應引物探針和對照物。檢測時將個體DNA或RNA樣本擴增到10的7次方倍，精準度幾乎可達到99.999%，這在行業里是共識?！庇袠I內資深人士告訴《21CBR》記者。

日常臨床診斷中，核酸檢測一直擔負結核、乙肝、甲流、艾滋病等多類病毒檢測的重任，成熟項目的檢測，準確率均可達到90%-95%以上。

據了解，一個完整的體外診斷產業鏈，合成試劑、診斷方案等產品后，再交付測序以及診斷類公司進行組裝成檢測盒，進入到臨床診斷，供給擁有檢測資質的機構使用；其關鍵在于原材料：試劑。高質量、高標準的試劑制備，直接影響檢測方法的可靠性與一致性。

沒想到，成熟的老技術，偏偏遇到新問題。張笑春是第一個公開質疑核酸檢測準確率的醫生。

2月3日，這位身處疫情一線的武漢大學中南醫院影像科副主任，在朋友圈高呼“別再迷信核酸檢測了”，其截圖廣為流傳，呼吁在武漢疫區，應以CT影像作為篩查的主要依據，給予核酸檢測陰性但CT影像陽性的人予以隔離，以防家庭聚集感染，使疫情進一步蔓延。

其后，陸續有感染者多次診斷“假陰”，個別病例經歷3-4次核酸測試才確診。由此，確診標準的討論進入公共輿論場。核酸檢測技術為什么失靈了？

倉促應戰

“核酸檢測本來是病原體檢測的最好方法，但是疫情情勢所迫，只能匆匆上馬，投入研究的時間和精力都不夠。”上海復星長征醫學科學有限公司副總經理楊志軍認為，由于疫情十萬火急，核酸檢測用品不得不倉促上陣，這是一個重要原因。

早在1993年，復星長征即研發了第一款醫療產品PCR乙肝診斷試劑，其后一直專注于試劑研發生產。

從時間周期看，通常一款新試劑，實驗室研發階段要在1年左右，加上臨床研究和報批時間，一般需要3年左右。現實是，疫情防控刻不容緩，試劑從研發到生產的時間，不足一個月。

“得到病毒序列后，設計多對引物和探針，進行原材料研究及檢驗，研發生產工藝和質量檢驗規程，進行半成品和成品檢驗，完成三批試劑的初步性能研究，如果加班加點，大概只要一個星期左右?！睏钪拒娬f，快速制作試劑固然可以，“然而，本質上只是一個科研試劑盒，不是臨床診斷試劑盒”。

應對疫情需要，應急審批下不得不省略很多研究內容，如生產工藝和質檢規程的可靠性研究、日間精密度、儲存穩定性、運輸穩定性、開瓶穩定性、適用樣本類型、樣本穩定性、陽性判斷值研究、臨床研究等重要環節。

舉例來說，試劑開發過程有一項重要環節，稱作“陽性判斷值研究”，要用大量已知結果的臨床標本，研究合適的陽性判斷方法。具體到應急批準的試劑，有單靶標、雙靶標、三靶標試劑。“各有各的陽性判斷方法，比較三種試劑的陽性判斷方法后，會發現明顯的沖突?！睏钪拒娬f。

比如，單靶標試劑檢測ORF1ab基因，只要檢測結果陽性，就認為患者感染新型冠狀病毒；雙靶標試劑一般檢測ORF1ab基因和N基因，兩個基因同時陽性才能判定為陽性。

如果單靶標試劑是準確的，那么雙靶標試劑會造成漏檢，因為多了一個限制條件；如果后者是準確的，那么前者存在假陽性，因為少了一個限制條件。

再看三靶標試劑，檢測ORF1ab基因、E基因和N基因，說明書上推薦的是ORF1ab基因陽性時，E和N任意一個陽性即可判定陽性，不只與前兩種存在差異，且又不同于主管部門的建議——三個基因中任意兩個陽性就判斷為陽性。

到底哪一種檢測試劑、哪一種判斷方法與臨床實踐最吻合，尚無定論。

從研發成本看，通常一款試劑的直接投入在百萬元上下，應急試劑的臨時性投入，成本則高得多，不只是人員調配，還有大量缺乏臨床病例研究下的試驗成本。

“我們不完全清楚病毒自身的特性和臨床表現，時間緊迫，開發試劑時也無大標本可用，很大程度上，陽性判斷方法只能憑經驗進行設定，所以，藥監局是以臨時應急審批的方式批準上市，而不是正式批準?！睏钪拒娊忉屨f，任何產品，生產不難，精準不易，核酸檢測試劑更是如此。

由于情況緊急，研發、生產、質量控制的各環節均受限于時間，因此，檢測試劑盒的品質很難保證。其實，即便產品好，也不能應對臨床診斷的現實問題。

不過，仇子龍認為，檢測試劑有質量問題的概率非常低，“核酸檢測試劑的生產并不難，基本不會成為檢測假陰性率高的原因，或者說只要樣本有病毒存在，能獲批的試劑盒，影響檢測質量的可能性可以忽略。”

操作之困

檢測盒的制備，到一線臨床運用之間，操作流程隔了幾道“門”，均會影響檢測準確率。

邵煒慧解釋，檢測試劑盒的準確程度與實驗結果，受到多環節、多因素影響，包括樣品病毒濃度、檢測操作標準等，比如，病毒濃度過低，逆轉錄后擴增也達不到檢測閾值，檢測盒檢測不到，就會導致假陰性。

有資深人士向《21CBR》記者解釋，造成假陰性結果的原因，矛頭不能單一指向核酸檢測技術或者質量問題。

“疫情嚴峻，在核酸檢測過程中，匆忙之中，試劑盒的冷鏈運輸、低溫存儲是否符合各大供應商溫度標準？在臨床采樣過程中，是否有效采到帶病毒的體液或者分泌物樣本？各大實驗室在檢測過程中，是否確保了實驗室環境滿足條件？均是非常重要的變量，這些會影響準確率?！?/p>

據了解，整個檢測過程要經過樣本收集、醫院登記、送檢、反饋結果等多個步驟，每個步驟是否嚴格執行，均會作用于最終結果。

以取樣為例，就大有學問。

從疾病自然史來說，從病毒入侵、復制直到上呼吸道、下呼吸道相繼出現癥狀，是一個連續過程，取樣時患者可能處于某一特定的階段。從病毒入侵到能夠檢測出的時間段稱為“窗口期”。

楊志軍坦言，現在不清楚新型冠狀病毒侵入人體的具體途徑，只能做出假設。從已發表的資料來看，從上呼吸道出現癥狀到呼吸窘迫的時間，大概3-7天，中位數是5天。

“一旦出現下呼吸道癥狀，病毒在上呼吸道樣本中的檢出率會降低，如僅僅取上呼吸道標本，就容易造成漏檢。”楊志軍說，目前上呼吸道采樣普遍用咽拭子，而從實際經驗看，鼻咽拭子的檢出效果會更好，至少，從過往甲流檢測看，鼻咽拭子相比咽拭子的檢出率要高10%-20%。

“新冠病毒專門感染下呼吸道，也就是肺部，肺部細胞感染病變后，產生的黏液和病變組織通過咳嗽的方式，也很難出來。”仇子龍告訴《21CBR》記者，一般患者無法采用肺泡灌洗液的方法，準確吸取肺泡組織附近的樣本，只能采取咽喉部棉簽刮擦取樣，而肺部病變組織卻未必能在咽喉處取得到。

單是取樣的原因，就可能造成患者出現“假陰性”。

此外，除了取樣本身難，對于檢測設備和人員都有要求，比如，實驗室的設備能不能高負荷運轉，配緩沖液的人手夠不夠？有些樣本檢測陰性后，是不是要多重取樣做復核？這些都影響檢測效率。一有瓶頸，就會體現在周轉時間長以及一次檢出率低，進而影響患者的最終確診。

即便如此，張笑春仍然公開解釋，并未否定核酸檢測結果，而是認為其作為檢測的最終手段，受到產量、采樣方式等限制，武漢等地無法完全依賴核酸檢測去篩查病人。

非常時非常法

對一線疫區的醫護來說，關鍵是提高效率，寧錯勿漏。

實踐中強硬一方主張將CT影像出現問題即確診，并視作“曹操式”操作，“寧可錯殺一千，不能放過一個”。特別是目前一線疫情診斷上，漏診、誤診現象并不少。也有一方相對穩健，強調完整的流行病學、影像學和病原學同時互補確診，要證據確鑿。

一位資深生物技術研究人員告訴《21CBR》記者，檢測界并不認同以CT影像為單獨診斷標準的建議，至少不認可大眾將CT和核酸檢測放在對立面上的做法。

在技術上，核酸檢測、CT兩者相互印證、雙向輔助無疑是最理想的。至少操作上，新型冠狀病毒感染肺部，咽喉處取呼吸道分泌物樣本進行核酸檢測，確實不易準確反映病情；而且，疫區大量感染人員往往處在疾病初期，用核酸檢測更不容易檢測。

大敵當前，非常時非常法。

從醫學診斷角度來看，如果在疫區肺部CT出現明確的臨床指征，有很大概率是新型冠狀病毒感染的肺炎，這樣“寧枉勿縱”，不等確診，馬上隔離治療，是阻隔傳染的最有效辦法。

一位曾參與抗擊SARS、現在一線支援的臨床醫生，向記者肯定了CT檢測的建議：“從目前數據看，插管病人從氣道分泌物中采樣的陽性率非常高，但是，由于其他取樣方法不到位等原因，實際檢出率還不夠，而CT就夠快，尤其在疫區，只要有白肺，十有八九就是新冠病毒感染，立刻確診隔離是最好的?！边@樣，在緊急關頭，就能起到有效甄別早期病癥的重要作用。

他告訴《21CBR》記者，不建議在其他地區采用此方法的原因是，很多流感感染也會引起白肺，加上其他地區的核酸檢測時間短，流程和武漢當地不一樣。

“以上海為例，一旦CT出現白肺，就進入該醫院隔離觀察區，耐心等待核酸檢測結果。從確診的技術角度，一定是要經過核酸檢測這一病原學確認的?！边@位醫生解釋道。

不過，臨床診斷采用CT檢測，在實際應用上，也具有挑戰性：掃描時間短，閱片時間長；檢查時間短，消毒時間長，其最大瓶頸是檢測通量小。

“病人一個接著一個做掃描，掃描時間只要幾分鐘，但是掃描結果要影像科醫生讀片。面對疑似病例，診斷室和CT機器必須做好全面消毒工作，工作量可想而知，與病患有接觸史的人可能達數萬名，在快速診斷方面會有挑戰?！背鹱育埜嬖V《21CBR》記者，用CT作為診斷方法還有一些其他問題，比如對于孕婦及兒童不一定合適，也不能排除其他病毒導致的肺炎。

這意味著，在湖北這樣疫情嚴重的地區，落實CT影像診斷，需要各方大量協同，協調資源。不過，官方在2月初即明確規定將CT影像結果作為湖北省診斷標準，也代表了決策層疫情防控“不落一戶、不漏一人”的決心。

亡羊補牢

CT對核酸陰性的典型癥狀者的診斷，固然有價值，但是，多位技術專家告訴《21CBR》記者，無論理論或實踐上，CT都不可能替代核酸檢測。檢測病原體，最可靠方法就是核酸檢測，效率和成本最理想。

截至衛健委發布的第六版診療方案，也依然將核酸檢測呈陽性作為確診的兩大標準之一。診斷業也加緊研發，以圖亡羊補牢。

比如，復星長征研發完成新型冠狀病毒核酸檢測試劑，并申請了國家藥監局應急審批。該產品可實現對新型冠狀病毒ORF1ab、N、E三個基因靶標的定性檢測。

截至2月初，該款試劑已完成300多例臨床標本，臨床數據來看，暫未發現“假陰性”問題，準確率相當高，配合自動化監測，可更快速檢測出無發熱、無癥狀患者。

“我們測算了全自動核酸提取儀的檢測效率，只要配套快速核酸提取儀及提取試劑，一個實驗室三個分區可連續作業，只需兩個操作人員，目前記錄是2小時內完成96個樣本的全部檢測?！睋钪拒娡嘎?，以此換算，一個三甲醫院，如果擁有3-5臺自動提取儀，一天檢測樣本可以超過1000人份，遠超目前200份/天的水平，使大規模篩查疑似患者成為可能。

1月底，A股上市公司凱普生物也宣布完成新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測試劑盒(熒光PCR法和Sanger測序法)兩款產品的研制工作，兩款檢測試劑盒在2小時左右即可出具檢測報告。

2月中旬，呼吸疾病國家重點實驗室對外透露，在鐘南山院士的指導下，其聯合多家機構研發出了新型冠狀病毒IgM抗體快速檢測試劑盒，相比RT-PCR核酸檢測，檢測更加簡單高效，靈敏度強和特異性高，“僅需采取一滴血就有望在15分鐘內肉眼觀察獲得檢測結果”。

“進一步提高檢測的精準度，試劑中長期穩定性、不同樣本類別及其穩定性、不同儀器臨床樣本檢測的匹配性等方面，都還要研究?！睏钪拒娬J為，盡管在補救，但是，本次疫情觸發的普遍質疑，已成為核酸檢測行業在臨床應用遭遇的第二次危機。

他引用了辛棄疾的一句詞形容當下的窘境：“元嘉草草，封狼居胥，贏得倉皇北顧?！?/p>

回想第一次危機，發生在1998年。由于核酸檢測濫用，當時主管部門不得不暫停其臨床應用，隨后，出臺一系列管理規定，舉辦多場次的臨床應用培訓班，使核酸檢測成為臨床信賴的檢測手段。

歷經20余年的努力，在新冠肺炎之前，沒有醫生質疑核酸檢測的可靠性。這一次，該項技術會陷入臨床一線以及大眾的輿論場，楊志軍也始料未及。他很遺憾，2003年SARS病毒之后，由于缺乏相應的制度支持，類似冠狀病毒的試劑研發沒有延續下去，否則不至于如此被動，這次的匆忙上架，大量從未做過呼吸道病毒檢測試劑的企業也不得不一起參與。

“這場危機要求行業內的每一個人認真反省，積極改進，我們要做好提前工作，而不是被病毒追著跑?！睏钪拒娬f。