第一章　卵母細胞的成熟機制及實踐

第一節　卵母細胞成熟機制概述

卵母細胞體外成熟（In vitro maturation，IVM）是指從卵巢中獲取未成熟卵，經過適宜的體外培養條件，卵母細胞發育成熟并具有受精和胚胎發育能力。哺乳動物卵母細胞體外成熟質量對卵母細胞的激活、受精及其后繼的胚胎發育均有重要影響。因此，對于卵母細胞成熟過程發生機理的深入了解和掌握，對提高卵母細胞成熟質量將發揮關鍵作用。卵母細胞的成熟包括胞質成熟和胞核成熟，在卵母細胞成熟過程中卵母細胞內經歷了一系列形態和生化變化，并逐步發育成熟。

（一）卵母細胞胞質成熟

目前，通常以第一極體排出作為卵母細胞核成熟的標志。在哺乳動物卵母細胞核成熟的過程中卵母細胞質也在經歷著成熟的變化。卵母細胞的胞質成熟質量對受精和胚胎發育起著決定性的作用，卵母細胞質中線粒體和皮質顆粒的變化是目前卵母細胞質成熟的研究重點和重要反映指標。

1.卵母細胞線粒體的變化

卵母細胞中含有豐富的線粒體，線粒體的活化與重組影響著卵母細胞的胞質成熟，線粒體的成熟狀況決定著卵母細胞發育成熟質量、受精成功等關鍵環節。線粒體在大部分未成熟卵子的細胞質中呈現周邊分布，線粒體簇較小，在卵母細胞成熟過程中，線粒體數量增加，并且從胞質皮質部向胞質內部發生遷移。IVM后，線粒體簇變大，著色變深，發育潛能較高的卵子的線粒體在細胞質中多呈均勻分布，發育潛能較低的卵子中，線粒體仍維持周邊分布。線粒體缺乏在胞質中的重新分布是胞質未成熟的標志，與卵子較低的發育潛能密切相關。卵母細胞發育過程中線粒體外遷和增殖，為卵母細胞和卵丘細胞的物質交換提供能量物質，定量研究發現在發育充分的卵母細胞中線粒體DNA復制在生殖泡期已經完成。另外，Combelles和Albertini研究發現，線粒體的分布是細胞質區室化一個較容易觀察的指標，細胞質區室化在卵母細胞細胞核和細胞質同步成熟方面發揮重要作用。

2.皮質顆粒（cortical granules，CGs）的變化

CGs在細胞質中的分布隨卵母細胞的生長發育呈現明顯的變化，合成初期散布于細胞質中，之后逐漸向皮質層遷移，排卵前呈單層排列于細胞膜下，卵母細胞活化后皮質顆粒明顯減少。在即將排卵的成熟卵母細胞中，皮質顆粒分布于皮質區，鄰近質膜處最多。當CGs位于卵母細胞皮質下則為胞質成熟，位于中部或由中部向邊緣遷移則為胞質未成熟。CGs的合成和遷移因物種不同而異，小鼠卵泡生長之初CGs開始合成，而人的則開始于已有數層卵丘細胞包繞的卵母細胞。隨著卵母細胞的成熟，CGs逐漸向細胞的皮質區遷移，當卵母細胞成熟時，CGs沿質膜呈線狀排列。微絲驅動著CGs的遷移，但當CGs定位于皮質層時不再受微絲的作用。由于皮質顆粒的分布特性，目前，卵母細胞成熟過程中CGs的分布被作為衡量細胞質成熟的指標。CGs是卵母細胞特有的一個細胞器，它對保證單精受精和胚胎正常發育有著重要作用。侯紹英等研究發現，巰基乙酸能夠抑制CGs的遷移，影響小鼠卵母細胞細胞質成熟，從而導致受精時無法實現正常CGs胞吐，造成受精后胚胎發育異常。

（二）卵母細胞核成熟

卵母細胞核成熟早于胞質成熟，研究核成熟對于提高卵母細胞質量意義重大。卵母細胞在進行減數分裂時，細胞核膜破裂，rRNA合成停止，核仁發生致密化，核內物質與胞質混合，形成生發泡破裂（germinal vesicle breakdown，GVBD）。GVBD發生后，染色體凝聚并排列在赤道板上，排出第一極體，直接進入第二次減數分裂并停滯在MⅡ期，顯示卵母細胞核已經成熟。目前，生發泡破裂和第一極體排出是卵母細胞核成熟的標志。Watson研究發現體內成熟的卵母細胞發育形成的胚胎比體外成熟的卵母細胞具有更強的發育能力，主要原因是體外培養的卵母細胞核成熟與胞質成熟不同步，在卵胞質積累發育必要的因子達到完全成熟之前卵母細胞核已經成熟。因此，通過抑制GVBD來阻滯卵母細胞減數分裂進程是促進胞質成熟和核質發育同步化的一條有效途徑。腺苷酸環化酶cAMP及其類似物雙丁?；佘账岘h化酶dbcAMP、磷酸二酯酶的抑制物等，均能抑制GVBD的發生，dbcAMP在卵母細胞體外成熟研究中常代替cAMP。目前，卵母細胞核成熟的抑制劑主要有異丁基甲基黃嘌呤（isobutylmethylaxantihine，IBMX）、次黃嘌呤（hypoxanthine，HX）和二丁基環一磷酸腺苷（dibutryrylcyclic AMP，dbcAMP）。除了直接提高cAMP的濃度外，在培養基中聯合添加IBMX或次黃嘌呤間接達到提高cAMP濃度的目的。IBMX是一種磷酸二酯酶抑制劑，它通過減少cAMP的降解提高cAMP濃度，HX則通過防止卵母細胞內cAMP水平降至抑制閾值以下來完成。周紅林等用Hx+dbcAMP或IBMX+dbcAMP聯合抑制，可使60%以上的綿羊卵母細胞抑制在GV期，并在去除抑制劑后卵母細胞恢復減數分裂，加快由GVBD到MⅡ的成熟過程。

磷酸二酯酶3（phosphodiesterase，PDE3）特異性抑制劑米力農（milrinone）能阻止cAMP的降解，用其處理牛、羊、小鼠、短尾猿及人的卵母細胞，結果均導致胞質cAMP的積聚，卵母細胞減數分裂的自發恢復受阻，延遲了卵母細胞的核成熟，從而有利于核質成熟的同步化，其機理可能在于cAMP是細胞周期蛋白激酶p34cdc2激酶的翻譯后調控因子，抑制了p34cdc2的磷酸化。當卵母細胞內cAMP水平下降時，cAMP依賴蛋白激酶活性下降，細胞內磷酸化與去磷酸化水平發生相應的改變，激活酪氨酸磷酸酶，催化p34cdc2發生去磷酸化，成為有活性的激酶，進而使多種蛋白質發生磷酸化。這些物質分別在轉錄和翻譯水平上控制減數分裂周期，影響微絲的排列與重組、中間絲的組合、核的重排等，進而使卵母細胞恢復減數分裂。馬利兵等在成熟培養液中添加適當劑量的米力農能顯著提高體外成熟的山羊卵母細胞的質量及孤雌激活后的卵裂率和囊胚率。Kim等用bcAMP處理豬未成熟的卵母細胞，經過22h成熟后，成熟率達91.3%，并在IVF后顯著減少了多精入卵，囊胚發育率增高。另外，蛋白激酶A能夠激活外源性dbcAMP，使大多數卵母細胞處于GV期，促使卵母細胞減數分裂同步開始，增強線粒體膜潛力和降低胚胎細胞凋亡，提高卵母細胞質量和發育潛力。Jensen等給恒河猴規律性飼喂摻有磷酸二酯酶抑制劑ORG9935的食物，發現ORG9935對恒河猴優勢卵泡的成熟具有抑制作用。Shu等在體外培養時用PDE3選擇性抑制劑西洛酰胺和佛司可林聯合處理人未成熟卵母細胞，兩者對卵母細胞的核成熟具有很好的抑制作用。

（三）G蛋白及其偶聯受體介導的信號通路

在卵母細胞成熟過程中G蛋白偶聯受體介導的信號通路起著重要作用。在研究信號傳遞時特指與細胞表面受體偶聯的異三聚體G蛋白（heterotrimeric GTP binding protein），存在于卵母細胞膜上，具有GTP酶的活性，即可以把GTP水解成GDP和無機磷酸。G蛋白由三種亞基組成。卵母細胞減數分裂過程中，信使與G蛋白偶聯受體3（Gsprotein-coupling receptor 3，GPR3）結合后導致受體構象改變，受體與Gs在膜上擴散形成受體-Gs復合體后，Gs亞基構象改變，結合了GTP而活化，亞基從而與亞基解離，同時暴露出與環化酶結合位點；亞基與環化酶結合而使后者活化，利用ATP生成cAMP，維持減數分裂阻滯。cAMP產生后，G蛋白受體與依賴cAMP的蛋白激酶（PKA）的調節亞基結合，通過磷酸化GPR3下調其活性，使cAMP鈍化或下降，促進卵母細胞成熟。Komatsu等認為卵丘細胞膜上存在一種GI/0蛋白偶聯的溶血磷脂酸受體，溶血磷脂酸與該受體結合后，通過Gi/o蛋白活化磷脂酶C，經磷脂酰肌醇信號通路激活蛋白激酶C，并進一步作用于細胞外信號調節激酶（ERK）和p38絲裂原活化蛋白激酶，導致卵母細胞內cAMP水平下降，促進卵母細胞成熟。

（四）細胞因子與卵母細胞成熟

卵母細胞成熟過程是一個多種因素相互協調作用的過程。研究發現細胞因子在卵母細胞的成熟過程中發揮著重要的調節作用，其中，卵母細胞成熟促進因子（maturation promoting factor，MPF）、細胞靜止因子（cytostatic factor，CSF）和卵母細胞成熟抑制因子（oocyte maturation inhibitor，OMI）等是目前在卵母細胞成熟過程中發揮關鍵作用的細胞因子。

1.成熟促進因子

1971年，在非洲爪蟾卵細胞質中發現有一種物質可以誘導卵母細胞成熟，這種活性物質被稱為MPF，又稱作細胞促分裂因子（mitosis-promoting factor）或M期促進因子（M phasepromotingfactor）。MPF的活性對于啟動減數分裂，維持減數分裂中期的休止以及促使MⅠ向MⅡ的轉變均具有重要作用。MPF由催化亞單位P34cdc2和調節亞單位cyclin組成，由M期Cyclin-Cdk（Cyclindependentprotein kinase）周期蛋白依賴性激酶和周期蛋白形成的復合物，MPF=p34cdc2+cyclinB/A。在真核生物中，MPF是細胞周期進程中調節減數分裂的重要細胞因子。p34cdc2具有蛋白激酶活性，能使多種蛋白質底物絲氨酸/蘇氨酸磷酸化。cyclinB是MPF的調節單位，其表達因細胞周期而變化，從而調節MPF的活性。從卵泡中獲得的卵母細胞的MPF水平很低，大部分處于G2期向M期轉變的生發泡期，在卵母細胞成熟過程中，兩次減數分裂轉變過程會伴隨MPF活性的下降。MPF的催化亞單位為p34cdc2，其活性受絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）的調控，MAPK是cAMP的下游因子，對磷酸酯酶Cdc25和蛋白激酶WEE1/MYT1起調節作用。另外，MAPK也可能通過磷酸化cyclin B使其向卵母細胞核內轉移，促進MPF活化和G2/M轉化。目前MAPK的激活物除了蛋白激酶外，人們對原癌基因的研究較深入。原癌基因是細胞基因組的正常成分，其編碼的產物多為細胞因子受體、核內蛋白質等一類同細胞信號傳遞有關的蛋白，與細胞的增殖分化和信息傳遞等有密切關系。Zheng等探討了原癌基因c-erbB2和c-myb對小鼠卵母細胞成熟的影響，及其在調控卵母細胞成熟中與MAPK和MPF的上下游關系，推測了c-erbB2和c-myb可能均為MAPK和MPF的上游激活因子。因此，MPF在卵母細胞成熟過程中調節活性的發揮受MAPK和一些原癌基因的調控。

2.細胞靜止因子

CSF最初是在未受精青蛙的卵母細胞中發現，CSF在卵母細胞質中維持周期素（cyclin）的磷酸化，使它不被降解，保持M期蛋白激酶活性，使卵母細胞停滯于M期。CSF的組成成分內源性減數分裂抑制因子2（endogenous meioticinhibitor 2，Emi2）是卵母細胞減數分裂過程中高水平MPF的一種促有絲分裂后期復合體（anaphasepromotingcomplex/cyclosome，APC/C）抑制因子，Emi2在第一次減數分裂期末開始合成，通過抑制APC/C活性使cyclin B發生不完全降解，促進MⅠ/MⅡ轉變。大多數哺乳動物的卵母細胞成熟至第二次減數分裂中期時就處于停止狀態，主要是由于CSF在發揮關鍵作用，從而使卵母細胞停止于第二次減數分裂中期而不發生退化。另外，CSF對Ca²⁺反應敏感，當精子發生頂體反應后，CSF的活性隨著卵母細胞的受精而消失，MPF恢復其活性，卵母細胞繼續發育。

3.成熟抑制因子

卵母細胞成熟抑制因子是由卵細胞周圍的顆粒細胞所分泌，參與卵母細胞成熟過程的調節。國內外學者先后在豬、牛和鼠卵泡液中分離獲得了卵母細胞減數分裂抑制因子，推測其可能是一種相對分子質量為35000的糖蛋白，化學特性尚未明了。體外試驗證明，OMⅠ能抑制卵子成熟，體外成熟培養初期，顆粒細胞分泌的OMⅠ濃度相對較低，尚不能抑制成熟分裂。在OMⅠ未達到閾值濃度時，卵母細胞的成熟分裂已啟動。在體內，OMⅠ通過卵丘細胞介導抑制垂體釋放卵泡生成激素。顆粒細胞分泌OMⅠ通過卵丘細胞與卵母細胞的間隙連接（Gap-function）對卵母細胞發揮作用，卵丘細胞存在時，激活環腺苷酸環化酶，阻止卵母細胞成熟分裂。另外，激活素促進卵母細胞的成熟可能是通過使OMⅠ失活而發揮作用。卵母細胞的成熟是一個復雜的動態過程，通過對卵母細胞成熟機制的深入了解和掌握，才能更好地利用卵母細胞成熟的規律為現代胚胎生物工程的發展服務。目前，眾多的實驗室在體外成熟-體外受精-體外培養及體細胞核移植等方面取得了成功，但與體內成熟卵母細胞相比，體外成熟的卵母細胞存在著受精率、卵裂率、囊胚發育率較低，囊胚細胞數較少，細胞胞質量差等問題。所以，通過對卵母細胞成熟機理的深入了解，卵母細胞的體外成熟體系將會更加完善，它必將推動核移植、轉基因、人類輔助生殖等的迅速發展。

（曹新燕）