緒論

一、動物生殖學的基本概念

一般而言，動物生殖學是指以動物生殖細胞或早期胚胎為研究對象，以細胞生物學、發育生物學、生殖生物學和分子生物學的原理和技術為基礎，對細胞或早期胚胎進行操作、加工或改造，研究細胞或早期胚胎的生長發育規律，以及調控其生長發育模式的一門綜合性技術科學。

在自然生理狀態下，不論是植物或動物，其細胞、組織或器官是在體內環境中完成其生命代謝活動的，細胞只在其既定的遺傳信息的指導下，按照自身的規律生長分化，表現自身特有的生物性狀和生理得以發揮其功能。

隨著生命科學和技術的發展，在充分認識生殖細胞的結構、組成和生物學特性的理論基礎上，動物生殖生物學技術可以在分子、亞細胞、細胞、組織或器官的不同水平上，借助專門的技術手段，于體外或體內環境條件下，對細胞進行操作或加工，研究其生長發育規律以及改造其結構或組成，進而了解其生物學功能及運用其特性，以實現人類所需動物產品的工程化生產。

二、動物生殖學的研究范疇

動物生殖學是生物科學學科的重要組成部分。然而在近50年來，隨著動物生物學科學理論的完善和科學技術的創新，動物生殖學在理論、技術及實際應用上，已成為一個具有自身特點的系統的學科，也是生命科學基礎理論和應用技術緊密結合的新型學科方向。

動物生殖學主要包括生殖器官的形態結構、生殖細胞的發生與調控機制、受精生物學和妊娠的機制、生理以及胚胎與母體的相容性等方面的內容，本書主要從卵母細胞的成熟機制及技術、生殖免疫反應（精子和胚胎）、胚胎發育的影響因素、動物輔助生殖技術理論與實踐（體外受精、核移植及優質精子的篩選技術等）及轉基因技術、干細胞技術等方面進行闡述和介紹。

三、動物生殖學的發展簡史

動物生殖學是在細胞學、細胞生物學、實驗胚胎學、發育生物學等學科的理論和實驗基礎上逐漸發展起來的理論性和實驗性很強的新型學科。生殖生物學的發展歷史相當久遠。

（一）動物配子與胚胎工程

哺乳動物胚胎工程的歷史可追溯到19世紀末。1890年英國劍橋大學的W.Heape首次嘗試兔的胚胎移植并獲得成功。他將4細胞期的安哥拉兔早期胚胎移植到比利時野兔的輸卵管內，結果產生了4只比利時仔兔和2只安哥拉仔兔。這個試驗第一次證實了動物的受精卵在異種母體內發育的可能性。

1912年Brachet將兔的胚泡培養于血漿凝塊中，觀察到了原溝和胎盤原基結構的發育。1922年英國的Biedl也進行了兔的胚胎移植試驗。與此同時，動物胚胎生長、發育和代謝及其環境條件等相關基礎研究也全面開展。1933年W.H.Lewis和P.W.Gregory體外培養兔早期胚胎通過了卵裂階段。

1935年美國的G.Pincus和E.V.Enzmannn比較了哺乳動物卵在體內和體外的行為特點。同年，W.H.Lewis和E.S.Wright研究了小鼠卵的早期發育。1930年Pincus用含有兔和雞血漿及兔和雞胚提取物的混合物懸滴培養，使兔的早期胚胎從2細胞或4細胞在體外發育到桑椹胚。從19世紀末到20世紀初，這些早期的胚胎移植試驗為以后農業動物胚胎移植研究的開展奠定了基礎。

1934年美國學者Warwick等移植綿羊胚胎獲得成功，從此拉開了家畜胚胎移植研究的序幕。Warwick（1949）又完成了山羊的胚胎移植。同年，Chang在培養基中添加加熱失活的血清培養兔2細胞胚獲得成功。這一成果激勵了用熱失活的血清作為培養基添加物開發農業動物胚胎培養系統的嘗試，使以后動物胚胎的體外長期培養技術得到了長足的發展。

20世紀50年代以后，相繼取得了豬（Kvasnickii等，1951）和牛（Willett等，1951）的胚胎移植的成功。繼之，規模性的羊胚胎移植技術體系建立了起來，并經過不斷改進，使胚胎移植的妊娠率大幅提高（Hunter，1955；Averill，1957），為羊胚胎移植在生產中的實際應用鋪平了道路。

1964年日本的杉江等和美國的Mutter等創造了牛胚胎的非手術移植方法，在胚胎移植技術上取得了重大突破，解決了牛胚胎移植因手術復雜、成本高、效率低等而難以在生產中推廣的問題。1973年，英國的Wilmut和Rowson移植牛冷凍胚胎產生了犢牛。1976年，Newcomb等建立了牛胚胎非手術采集技術。

這些關鍵技術的突破使動物胚胎的采集、培養、保存和移植的技術體系趨于成熟，使得農業動物的胚胎移植技術在生產中全面推廣。期間，在世界許多國家成立了商業性胚胎移植機構，從事動物胚胎的銷售及胚胎移植技術的培訓和推廣。尤其是1974年國際胚胎移植學會的成立，進一步促進了胚胎移植相關理論和技術及經驗的廣泛交流和深入發展。

20世紀80年代以后，胚胎移植技術在野生動物和珍稀動物的保存和繁殖上也得到了應用。胚胎移植技術的商業化在世界范圍內的引種、優良品種家畜的推廣、種畜的快速擴繁、低產家畜的改良、動物的遺傳育種、畜牧業經濟的發展方面發揮了不可估量的作用。

（二）動物體外受精

早在1672年de Graaf首次描述了哺乳動物的卵泡，認為卵泡中含有卵和類似于卵的物質。1677年Antony von Leeuwen Hoeke首次觀察到了人類和哺乳動物的精子。Carl Ernst von Bear 發現了哺乳動物真正的卵，于1872年發表了《論哺乳動物和人類卵的起源》一書，他在犬的輸卵管中找到了卵子。

1876年O.Hertwig首先發現了動物的受精現象。2年之后，德國學者Schenk就進行了哺乳動物體外受精的嘗試。他把排卵前的卵母細胞和取自附睪的精子于子宮液中孵育，結果發現了第二極體的釋放和卵裂。但此后數十年里，體外受精的研究似乎沒有顯著的進展。20世紀50年代以前，雖然進行體外受精的研究，但也主要集中于無脊椎動物（如海膽）和非哺乳類脊椎動物（如蛙和魚）。

1951年美籍華人張明覺和澳大利亞學者Austin同時分別發現了哺乳動物精子的獲能（capacitation）現象。他們經過對兔的受精試驗研究，發現精子只有在雌性生殖道內停留一定時間才具有使卵受精的能力。這一生理現象的發現對動物體外受精研究具有劃時代意義。1954年，Thibault等報道采用從家兔子宮收集到的獲能精子受精獲得成功，使精子獲能理論得到了進一步證實。

1959年張明覺應用體外受精技術首次在世界上產生了試管兔，推動了動物體外受精研究的廣泛開展。1964年Yanagimachi和Chang采用體外獲能和體外受精技術獲得了試管倉鼠。這項研究極大地簡化了以前精子獲能所經歷的許多繁瑣而經驗性的程序。這一技術的誕生促使體外受精進入了快速發展的軌道。

1965年Edwards等首次進行了牛排卵前卵母細胞的體外培養。1978年，英國的Steptoe和Edwards首次用體外受精技術獲得了試管嬰兒，在人類的輔助生殖治療不孕領域取得了重大突破，也標志著這一技術開始造福于人類。進入20世紀80年代以后，開始考慮將體外受精技術應用于農業動物的繁殖生產。

1982年Brackett等報道用體內成熟的卵母細胞經體外受精產生試管犢牛。隨后，試管山羊（花田章等，1984）、綿羊（花田章等，1985）、豬（Cheng等，1986）、水牛（盧克煥等，1987）和馬（Palmer等，1991）應運而生。同時，體外受精技術在部分靈長類動物中應用并獲得了試管后代，如恒河猴（Bavister等，1984）、狒狒（Clayton和Kuehl，1984）、絨猴（Lopata等，1988）、美洲虎（Miller，1990）。

在體外受精研究的同時，開展對與其相關的配子的采集、配子的培養、培養液的配比、培養條件等各環節技術進行研究并改進，使體外受精技術體系日臻完善，并商業化應用于農業動物的繁殖生產。我國從20世紀80年代以后，先后完成了各種家畜的體外受精研究，并獲得了一批試管家畜，廣泛應用于家畜的改良育種。

對于某些動物，由于其卵母細胞成熟和精子體外穿透透明帶的特殊性，阻礙了體外受精的實際應用，在20世紀80年代，成功開發出了嚙齒動物和家畜顯微受精技術，如透明帶切口（Talansky，1986）、透明帶下顯微直接注射（Mann，1988）、卵胞質內精子注射（Hosoi等，1988）。此項技術已在家畜和野生哺乳動物得到了應用，尤其是在人的輔助生殖及不孕不育臨床治療方面作出了巨大的貢獻。

（三）動物克隆技術

1.胚胎細胞克隆動物

1875年Van Beneden首次報道了兔的受精過程。1895年Sobotta首次報道了小鼠卵成熟、受精和卵裂的過程。1880年Wilhelm His發表了第一部《人體胚胎學》，描述了早期胚胎卵裂球的發育能力。1887年德國胚胎學家W.Roux將蛙的2細胞胚刺死其中的一個卵裂球，但未取出，另一個活的卵裂球發育成具有半個身體的胚胎。

此后，德國胚胎學家和解剖學家O.Hertiwig也將蛙的2-細胞胚的卵裂球刺死一個并取出，剩下的另一個活的卵裂球發育成一個完整的胚胎。1892年Driesch將海膽2細胞胚振蕩分離成兩個卵裂球，各自單獨培養后，均發育成正常的幼蟲，只是個體較小。進一步研究還發現2細胞到4細胞胚胎階段的每個分裂球都有能力發育成完整的幼體，該結果首次證明了早期胚胎細胞的全能性。這也是最早進行人工胚胎分割的實驗。

同年，Wilson分離文昌魚2細胞胚，每個分裂球均能獨立地發育成正常的個體。在此后的30年中，有關動物克隆的研究沒有什么新的進展。直到1933年Conklin通過振蕩將文昌魚的2細胞和4細胞胚分離成單個的卵裂球，沿分裂面分開的左右兩個卵裂球能發育成兩個完整的幼蟲，動物克隆的技術體系逐漸建立起來。

1938年德國胚胎學家H.Spemann進行了極其有趣的實驗，他用嬰兒的頭發將蠑螈的受精卵結扎成兩部分，一部分含有細胞核，另一部分只含有細胞質，經過培養，有核的部分發生了卵裂，而無核的細胞質未能卵裂。待有核的卵增殖到多個卵裂球時，松動結扎，將每一個卵裂球釋放到無核的胞質部分，結果重新獲得細胞核的半胚均能發育成正常的胚胎。Spemann的實驗證明了桑椹胚的每個卵裂球均具有發育全能性，也從此拉開了動物細胞核移植研究的序幕。

1939年法國學者Commandon和de Fonbrune獲得了具有分裂生殖能力的核移植變形蟲，在單細胞生物上證明了核的發育全能性。1952年Briggs和King將蛙原腸期胚的細胞核移植到同種蛙的去核卵子中發育成了蝌蚪。1958年Tung用玻璃針將文昌魚的2細胞和4細胞胚剝離分成完全分離的卵裂球，經過培養，每個卵裂球均具有發育成為正常成體的能力，驗證了Conklin的實驗結果。

1962年Gurden將蝌蚪的上皮細胞核移植到用紫外線照射去核的爪蟾卵內，獲得了體細胞克隆蛙，并獲得了連續核移植成蛙（Kobel等，1973）。1965年Smith移植蛙的原生殖細胞（primordial germ cells，PGCs），移植胚也發育到了蝌蚪期。

我國開展核移植研究始于20世紀60年代，1963年童第周等首次進行了魚的核移植實驗，獲得了核移植魚。這些研究結果證明了部分分化的體細胞在合適的條件下，能恢復其全能性而發育成成體。這些實驗雖然是在兩棲類動物上進行的，但這是哺乳動物克隆或核移植技術誕生和快速發展的理論基礎。

Mülin于1970年將小鼠的2細胞胚分離成2個卵裂球培養，移植后產生了兩個子代小鼠。這是首次進行哺乳動物克隆成功的嘗試。1979年S.M.Willadsen將綿羊的卵裂胚分離成多個獨立的卵裂球，培養移植產生了多個同質的子代羔羊。

1981年Illmesee和Hoppe報道了小鼠囊胚內細胞團細胞注入合子后，產生了3只核移植小鼠。但很長時間未能重復獲得這一結果。

1983年McGrath和Solter改進了核移植技術，建立了顯微注射和細胞融合構建重組胚的技術路線。以后經過逐步完善，廣泛應用于動物的核移植。相繼誕生了胚胎細胞核移植兔（Stice等，1988；陸德裕等，1990）、山羊（張勇等，1991）、牛（Prather等，1987）、豬（Prather等，1989）、猴（Meng Li等，1997）。Willadsen（1986）通過透明帶切口移植法，獲得了核移植綿羊。

20世紀90年代以后，以胚胎干細胞為核供體的核移植牛（Sims等，1993）、以胚胎胚盤細胞為核供體的核移植綿羊（Campbell等，1995）以及繼代或連續核移植牛（Stice，1993）和山羊（鄒賢剛等，1995；張涌等，1996）相繼問世?，F在，胚胎細胞的核移植技術基本實現了產業化。

2.體細胞克隆動物

成年體細胞克隆動物技術雖然在魚類和兩棲類早已成功，但其真正的突破是英國學者Wilmut等（1997）用綿羊乳腺上皮細胞為核供體，誕生了世界第一只體細胞克隆綿羊“Dolly”?？寺【d羊的出生標志著哺乳動物的克隆技術進入了一個新的發展階段。

1998年Wakayama改變了技術路線，將小鼠的卵丘顆粒細胞直接注射到去核的小鼠卵母細胞的胞質內，產生了30多只體細胞克隆小鼠。繼之，以卵丘顆粒細胞為核供體的克隆牛（Kato等，1998；Wells等，1998）、山羊（Baguisi等，1999；王玉閣等，1999；張涌等，2000）、豬（Polejaeva，2000）相繼產生。

以子宮上皮細胞和肌肉細胞為核供體的克隆牛（Kato等，1998）、來自自體皮膚細胞的克隆馬（Galli等，2003）、以耳部皮膚細胞為核供體的克隆水牛（石德順等，2005）降生。但到目前為止，體細胞克隆動物的成功率仍然較低，尚有待于進一步研究。

異種間動物核移植研究始于20世紀70年代。1977年De Roeper等將Hela細胞注入非洲蟾蜍卵內以探索核質相互作用和DNA的表達行為，發現重構胚可以發育到囊胚期。在此之后的十余年間，異種動物核移植的進展似乎不大。

1990年Wolfe等以家牛胚胎細胞為核供體，分別以北美野牛、山羊和倉鼠的去核卵母細胞為核受體，融合胚經體外培養后，家牛和野牛、家牛和山羊的異構胚均發育到了囊胚期。1993年梅琪等構建了小鼠胚胎細胞核與去核兔卵母細胞的鼠兔異質胚，將其移入受體以后，發育成了囊胚。

1999年陳大元等分別用成年大熊貓的骨骼肌細胞、子宮上皮細胞和乳腺細胞與兔去核卵母細胞構建的異質胚均發育到了囊胚階段。核型分析表明異質胚的遺傳物質來源于大熊貓的體細胞核。這些實驗說明了異種動物的細胞核與細胞質之間在胚胎的早期發育階段沒有種屬特異性。

同年，Lanza用人的體細胞為核供體，與牛的去核卵母細胞構建的異質胚，在體外培養條件下，也發育到了囊胚。這一結果預示著人體細胞和動物卵母細胞異質克隆技術有可能成為解決人類胚胎干細胞來源的新的途徑。體細胞異質克隆技術取得突破性進展的是以野牛的體細胞為核供體，用家牛的去核卵母細胞為核受體，誕生了世界首例異種動物克隆野牛（Vogel G，2001）。但存活2天后因感染而死亡。

隨之，體細胞異質克隆野生盤羊也獲得成功（Loi等，2001）。值得一提的是，分別用胎兒期騾子和成年騾子的體細胞為核供體，以馬的去核卵母細胞為核受體的克隆騾子也均已誕生（Gordon等，2003）。

異種克隆動物的出生為拯救瀕危動物和逾越遠緣雜交不育的壁壘提供了極其重要的思路和技術。在克隆過程中發現，核供體細胞的細胞周期是克隆胚發育啟動的重要因素，當供體核和受體卵母細胞胞質的細胞周期同步時，克隆胚的發育才能進行。

（四）轉基因動物技術

轉基因動物研究始于20世紀70年代。1974年，R.Jaenisch和B.Mintz通過逆轉錄病毒轉染小鼠著床前胚胎，首次獲得了整合SV40（simian virus 40）DNA的轉基因小鼠。1977年Gurdon將mRNA和DNA注射到爪蟾卵內，觀察到轉入核酸的表達。1980年Brinster等用同樣的方法在小鼠的受精卵內也觀察到了相似的結果（兔珠蛋白mRNA的翻譯產物）。

這些最初的研究為轉基因動物技術的發展提供了重要的啟示和理論基礎。Gordon等（1980）通過質粒重組將SV40基因和HSV的TK基因顯微注射到小鼠受精卵的原核中，也獲得了轉基因小鼠。1982年Palmiter和Brinster將大鼠的生長激素顯微注射到小鼠的受精卵中，獲得了肝臟能分泌生長激素的“人工超級小鼠”。

這是用基因工程技術改造動物表型的第一個例證，并提出了從轉基因動物中提取藥物蛋白的設想。這一研究成果引起了當時學術領域的很大反響。

試圖通過基因重組和轉基因技術，將外源基因導入家畜的基因組以提高其生產性能或培育新的家畜品種成了生物學界極為感興趣的課題。1985年Hammer等最先將小鼠金屬硫蛋白（MT-1）基因的啟動子/人生長激素的重組基因（MThGH）分別注射到綿羊、兔和豬的受精卵中，結果在所獲得的轉基因豬和兔的血液中檢出了人的生長激素。

接著，Vize等（1988）的研究結果也表明一些轉豬生長激素基因豬，其生長率比原品種高13%，飼料利用率高17%。然而，并非所有的轉基因動物像人們所設想的那樣，在某些性能上均有所提高。Ebert等（1990）的研究就得出了相反的結果。而且，在后來的眾多研究中發現許多轉基因動物的生產性能不但沒有提高，反而表出現了生活力減弱、代謝紊亂、畸形多發等問題。

所以，以提高農業動物經濟生產性能為宗旨的轉基因動物的研究逐漸降溫，而以生產醫學用人體蛋白或食品用蛋白的生物反應器建立的研究卻方興未艾。

細胞工程研究的物質基礎是動物細胞，其產生的理論基礎是細胞的生物學本質屬性，即全能性、多能性、可塑性等，即不論是動物體或是植物體，構成其器官或組織的終末分化的功能細胞仍然具有重新發育為完整個體的潛能。細胞的發現迄今已逾300多年，并將其定義為生物有機體形態結構和生命活動的基本單位。

在此意義上細胞亦即代表了生命的基本元素，生命學科歷來是自然科學研究中最為活躍的領域，因為生命活動在自然界中具有無與倫比的意義。隨著生物科學理論和技術的發展，在細胞生物學研究的基礎上，人們探索對細胞的操作和改造。細胞的發現真正開啟了探索生命奧秘研究的大門，細胞的操作賦予了生命以創造性的意義，是人類對細胞科學研究的質的飛躍，曰之“設計生命，創造生命”并不為過。

（五）動物干細胞工程

1.胚胎干細胞

胚胎干細胞是在小鼠畸胎瘤細胞（teratocarcinoma-derived stem cells）體外培養研究的基礎上發現的。1958年Stevens最早發現了畸胎瘤干細胞，并將小鼠的早期胚胎移植到睪丸或腎臟的被膜下，首先獲得了畸胎瘤干細胞。繼之，Brinster（1974）和Stewart（1982）獲得了畸胎瘤干細胞嵌合體。

在此基礎上，Prea等（1989）從人畸胎瘤組織中分離并建立了ES細胞系。令人感興趣的是1981年英國劍橋大學的Evans和Kaufman成功地從小鼠延遲著床的囊胚中分離獲得了小鼠的內細胞團并首次建立了小鼠胚胎干細胞系，此后Martin（1981）、Magnuson（1982）、Axeord（1984）也取得了小鼠胚胎干細胞分離及建系的成功。

自此，研究者相繼分離并建立了倉鼠（Doetschman，1988和Piedrahita，1990）、大鼠（Iannaccone等，1994）的類ES細胞系。Petitte等（1994）描述了鳥類ES細胞的培養，Park等（2000）報道了源自雞性腺PGCs的ES細胞的建立。目前小鼠的ES系的分離、克隆技術在某些品系已成熟完善，并成為研究哺乳動物早期胚胎發生、組織細胞分化和基因表達調控等研究的一個較為理想的模型系統。

20世紀90年代以后，在嚙齒哺乳動物ES細胞分離建系研究的基礎上，相繼分離獲得了豬（Notarianni，1990；Strojek和Piedrahita，1990；Evans，1990）、牛（Saito等，1992；Strelcheno等，1994；Stice等，1994）、兔（Grave等，1993；Nremann等，1994）、水貂（Sukoyan，1994）等的類ES細胞。然而，雖然這些動物的ES細胞的特性在某些方面類似于小鼠的ES細胞，但沒有確切的科學證據表明這些動物的ES細胞具有能形成嵌合體的能力，因此，所獲得的這些細胞暫且稱作類ES細胞。

Bongso（1994）用人輸卵管上皮飼養層培養原核期胚胎，獲得了增殖傳代的ES細胞克隆，初步證明了人的類ES細胞建系的可能性。Thomson等（1995，1996）分別從恒河猴囊胚中分離并建立了ES細胞系，在胚胎干細胞研究領域首次獲得了靈長類的ES細胞系。

取得突破性進展的是美國威斯康星大學Thomson等（1998）分離人的內細胞團細胞并成功地建立了人的ES細胞系，與此同時，霍普金斯大學的Gearhart等和Shamblott等分別從人的原始生殖細胞建立了胚胎生殖細胞系。

在哺乳動物ES細胞的分離取得成功以后，研究內容集中于ES細胞的發育潛能方面。Stice（1994，1996）用ES細胞構建的重組胚發育到55～66天的器官形成期；Modlinski（1996）獲得了嵌合體羔羊；Campbell（1996）用綿羊的ES細胞為核供體移植產生了后代。澳大利亞、日本、以色列、新加坡等國的科學家也先后從體外受精卵分離獲得了人和猴胚胎干細胞系，并誘導胚胎干細胞分化生成神經細胞、肌肉細胞、造血細胞和胰島細胞等。

2.組織干細胞

近幾年來，研究發現干細胞不僅存在于早期胚胎內細胞團，而且在成體各器官組織中也廣泛存在。存在于成體組織中的干細胞被稱為成體干細胞，且是多能或專能性的。已證明由內胚層、中胚層和外胚層發育而來的組織均存在干細胞，已分別從中樞神經、軟骨、胰腺、視網膜、肌肉、骨髓、肝臟、臍帶血、皮膚組織、性腺等組織分離獲得了干細胞。

除果蠅之外，幾乎所有動物體組織（如斑馬魚、海鞘、原口動物等）都有組織干細胞的存在。研究表明干細胞具有橫向分化的能力，如神經干細胞和骨髓干細胞經誘導分化為神經元或肌肉細胞等。

2006年加拿大學者Dyce等將豬胎兒皮膚干細胞體外誘導分化生成了類卵母細胞。德國學者體外誘導小鼠胚胎干細胞分化生成精子（Karim Nayernia等，2006），顯微注入卵母細胞并移植到受體后，成功地產生了活的后代。同年，又誘導小鼠骨髓干細胞分化成精子細胞（Karim Nayernia等，2006）。

組織專一干細胞的發育潛能已超越了胚層的界限。這是20世紀末和21世紀初干細胞研究的重大發現，并賦予了干細胞研究以寬廣的外延和新內涵。其中導致干細胞分化的誘導因子及干細胞的分化機理和干細胞的鑒定是干細胞研究領域的重要內容。研究發現不同的誘導因子會導致干細胞向不同的功能類型的細胞分化并已發現了許多種不同的誘導因子，包括化學的、物理的和生物的因子。目前研究人員致力于干細胞的誘導模式和標志物及分化調控機制的研究。

我國開展胚胎干細胞的研究始于20世紀的80年代末，進入90年代小鼠胚胎干細胞的分離和建系研究取得了顯著的成效。叢笑倩（1990）、柴桂萱等（1996）、徐潔（1991）成功地建立了小鼠的ES細胞系，并獲得了嵌合體小鼠。賴良學（1995）獲得了ES細胞的嵌合體兔。竇忠英等（1995、1996、1998）分離獲得了豬、牛、山羊等的類ES細胞，干細胞的研究達到了世界先進水平。近年來以人的疾病治療為目的的成體干細胞研究在我國也相繼開展。

四、動物生殖學的應用及前景

動物生殖學作為一個獨立的生物科學的主導領域誕生和發展的歷史悠久，且已廣泛地滲透到人類生產和生活的各個方面，并產生了極其深遠的影響。其應用的廣度和深度在醫學、生物、農業等領域獨樹一幟，可以說已超越了本身。

隨著動物生殖學在理論和技術上的不斷深入和突破，其實際應用的價值之大、優勢之強將是傳統技術無可比擬的。根據近幾十年來動物細胞工程技術在實際應用中所涉及的范圍及所取得的成就，將其在各領域的應用分述于下。

（一）醫學領域

細胞工程技術在人類疾病的現代醫學治療中發揮了極其重要的作用，傳統醫學難以治療的疾病卻用細胞工程技術得到了有效的治療。干細胞（包括胚胎干細胞和組織干細胞）是動物細胞工程學研究領域的重要內容，隨著干細胞生物技術的開發，它在人類疾病特別是疑難病癥的臨床治療中的應用，優勢和地位越顯突出。

近幾年來，研究人員已成功地從人和鼠的胰腺組織中分離出了胰腺干細胞，經分化誘導生成了胰管細胞和胰島細胞并能分泌胰島素。干細胞移植技術已在人的糖尿病治療上開始了嘗試。

科學研究人員也正在考慮、嘗試將干細胞移植技術應用于在過去認為不可能治愈的疾?。ㄈ缗两鹕。┑呐R床治療或神經損傷后的修復和再生等。

除了將干細胞移植技術直接用于某些疾病的治療外，干細胞工程結合現代分子生物學技術，通過遺傳修飾，用于人類遺傳疾病的基因治療在科學和醫學界也已取得了共識，使多少在過去認為是“不治之癥”的頑疾被攻克?？梢灶A見，干細胞工程在現代醫學臨床治療中必將成為極其有效的技術手段，對傳統醫學的改造和現代醫學的創新產生深遠的影響。

動物生殖生物技術在人類的人工輔助生殖、不孕不育疾病的輔助治療、計劃生育及優生優育方面的應用展現了廣闊的前景。少精癥、無精癥、精子活力差或受精能力弱是造成男性不育的常見病，患者的精子往往不能經歷自然的受精過程而使卵子受精，對此，可借助于人工輔助生殖技術（assisted reproductive technologies，ART）來達到受精的目的。

采集患者的精子，用胞質內精子注射技術（intracytoplasmic sperm injection，ICSI），將其注入卵子內，經體外培養（in vitro culture）發育到一定階段，根據胚胎的發育程度，再移植到受體的輸卵管或子宮內繼續發育，直到胎兒的降生。

對于因卵子胞質存在問題而不能正常受精的不孕癥患者，將其卵子取出，使卵胞質用來自健康婦女的卵胞質置換，而不改變其遺傳物質，經體外受精和培養及胚胎移植，同樣可達到懷孕生子的目的。

在配子水平上，選擇質量優秀的精子和卵子受精，監控生產高質量的胚胎，排除不良胚胎懷孕，產生健康的后代，實現人口的生殖健康和優生優育，進而提高人口的質量。采用超數排卵或胚胎分割（splicing）技術，可實現一胞雙胎或一胞多胎。

結合冷凍保存技術（cryopreservation），將來源相同的胚胎超低溫冷凍后長期保存，若在孩子成長過程中不幸夭折，可隨時隨地將冷凍保存的同型胚胎解凍，再移植到母親或代孕母體的輸卵管或子宮，可再生遺傳和表型相同的孩子，減輕遭遇不幸家庭的失子痛苦。

1978年誕生于英國的世界第一個試管女嬰，發育正常，健康成長，并能正常懷孕，于2006年成功地分娩產生了一個健康女嬰。這一成功范例也進一步證明了細胞工程技術在人類生殖中應用的可行性。1988年中國的首例試管嬰兒出生。通過生殖細胞工程誕生的試管嬰兒分布于世界各個國家。

細胞工程應用于人類生殖的另一方面是避孕藥物的研制。以精子表面蛋白和卵子透明帶蛋白或早期胚胎為抗原制備單克隆抗體，作為免疫避孕疫苗接種，高效無毒，可以實現健康避孕的目的。這樣可有效地避免口服避孕藥的不便及其副作用給人類的健康造成的有害影響。

動物生殖細胞工程技術在人類細胞、組織或器官移植中也具有重要的應用價值。就目前的科技發展水平，可視為兩個方面。其一，是人類機體的細胞、組織或器官的再生或克隆。其二，是細胞、組織或器官移植過程中免疫排斥反應的克服。

如上所述，通過動物干細胞技術有望生產各種功能細胞、組織或器官，其前景雖然十分誘人，但離理想中的普遍應用還相當遙遠，何況存在干細胞的移植成瘤問題。目前真正通過誘導產生并能用于臨床治療的細胞或組織還極其有限。用于臨床移植的組織或器官還是依賴于人類的捐獻來提供。

然而，在人類間器官移植的醫學治療中，不僅可供移植的器官嚴重缺乏，而且存在異體免疫排斥反應的障礙。即使通過藥物可以控制排異反應，但其長期的用藥費用極其昂貴?；诖?，研究人員試圖尋求用異種動物的組織器官來代替人類的組織器官用于移植治療。

但醫學實踐證明，異種動物間的組織器官移植，很難克服迅速而激烈的排異反應。要想將動物的組織器官移植給人體，首先要解決排異反應問題。而要解決排異反應，則必須知道引起排異反應的分子機制。

關于異體間的排異反應的分子機制目前已基本清楚，在此基礎上，克隆其中的關鍵調節基因，通過轉基因技術將該基因轉移到供體動物的基因組中，并在體內表達。當將轉基因動物的組織器官移植到人體時，就有可能不再發生排斥反應，最起碼排斥反應減輕。

基于這一原理，世界各國研究人員用轉基因技術將人類的主要基因轉移到動物的基因組中，試圖培育含有人基因的動物品系。在20世紀90年代，英國已培育出含人類基因的豬群體。2007年，美國也成功地培育出含人類15%的基因的綿羊群體。

動物實驗表明，將轉人基因的豬心臟移植到猴的體內，能渡過超快排斥反應期，取得了良好的效果。在不遠的將來，將動物的組織器官移植給人體，挽救患者的生命，有望成為現實。

一旦獲得理想的適合人類免疫系統的轉基因動物個體，則可通過超數排卵技術、體外授精技術、胚胎移植技術、動物克隆技術等在短時間內迅速擴繁，建立群體。轉人類基因的動物將有可能成為人類器官移植的主要供體來源，為需要接受組織器官移植的患者帶來了福音。不過，隨之帶來的對人體的安全性問題，在移植試驗研究的同時，也需要做深入的探討。

（二）動物遺傳育種與繁殖

高產優質的家畜生產目標的實現在于家畜品種的改良，動物細胞工程作為一項高科技生物技術應用于家畜品種的遺傳改良發揮了巨大的作用，這里主要是指胚胎工程的系列技術的應用。精液稀釋、冷凍保存、性別精子分離、超數排卵、卵母細胞的采集、體外成熟、體外受精、體外發育、性別鑒定、胚胎分割、胚胎冷凍、胚胎移植、轉基因技術和動物克隆等廣泛用于家畜品種的改良和繁殖。

精液的稀釋、冷凍保存和人工輸精技術的應用推廣使優秀種雄性動物的使用效率和畜群的遺傳改良速度提高了幾十倍，曾經使動物的繁殖生產發生了革命性的變化。

超數排卵技術的使用使優秀雌性動物的遺傳資源得以充分挖掘，遺傳性能得到了最大限度的發揮，尤其對于單胎家畜，其繁殖效率提高了5～10倍。

需要強調的是幼畜的超數排卵使優秀雌性動物的利用時間提前了2～3年，正常生長發育情況下，雌性動物的年齡達到體成熟以后方可繁殖后代，超數排卵技術可使畜群的世代間隔大大縮短，從而加快了遺傳進展和育種改良進程。幼齡雌性動物的超數排卵技術還能利用被淘汰的幼雌性動物的卵巢卵母細胞，充分利用了優秀雌性動物的遺傳資源。

胚胎冷凍技術使種畜的引進由過去的活體引進變為現在的胚胎引進，擴大了引種的規模，而又大大地降低了引種成本，引進的家畜胚胎還可長期保存。

通過胚胎移植技術在短時間內迅速擴大種用群體的數量，建立良種核心群。如MOET（multiple ovulation and embryo transfer）技術成功地應用于奶牛育種核心群的建立。

性別（XY）精子分離技術可將雌性（X）精子和雄性（Y）精子分離開來，用雌性精子授精獲得后代雌性動物的比例達到95%以上或者更高。不僅能快速有效地擴大生產性能特別優秀的種雄性動物的利用率，提高家畜的改良速度，而且極大地節約了飼養成本。

該技術在限性性狀的家畜如奶牛的繁殖生產中具有廣闊的應用前景。同理，用雄性精子受精獲得后代幾乎全部是雄性動物，在肉用家畜的繁殖生產中應用價值很大，因為雄性動物的生長速度要遠快于雌性動物，飼料的轉化率高，可獲得更高的經濟效益。

用動物轉基因技術可培育具有新性狀的動物品種或提高動物的生產能力。轉基因技術用于動物的抗病育種，旨在培育高抗病性的家畜品種。烈性傳染病每年給動物生產造成了嚴重的威脅和巨大的經濟損失，因此研究人員設想通過轉基因技術培育抗某種疾病的家畜品種，如抗雞瘟病毒的雞和抗豬瘟病毒豬。

將某些抗病毒基因導入動物的早期胚胎并整合到胚胎的染色體中，或將該基因轉入體細胞的基因組，通過動物克隆技術獲得轉基因克隆胚，移植后產生克隆后代，有可能獲得抗該病毒的性狀。

轉基因技術應用于動物生產主要是將生長激素（growth hormone，GH）基因或生長激素釋放因子基因導入動物的基因組，有望獲得生長速度快、產肉或產奶率高、繁殖性能強的轉基因后代，以提高動物生產的經濟效益。

據報道，轉MT-GH基因豬的增重率提高50%，飼料利用率提高80%。我國獲得的轉基因豬其生長速度、飼料轉化率和瘦肉率都明顯提高。然而，動物轉基因技術也存在許多問題，諸如目的基因的整合和表達不易控制、遺傳不穩定等。目前雖然能通過基因打靶（gene targeting）技術將目的基因定點整合到染色體上，但其表達仍然是隨機的。這些問題尚有待于進一步研究。

早在20世紀60年代，我國就最早進行了魚的胚胎細胞的核移植研究，并獲得了移核魚。轉基因技術在魚的培育中的應用也取得了顯著成績，我國已成功地培育出了轉人生長激素基因魚，其體重比原品種增大了數倍。

多倍體技術和雌核發育（gynogenesis）技術在水產養殖動物的育種與繁殖中得到應用。

（三）瀕危動物保護

動物生殖細胞工程在動物物種保護中的應用可分兩個方面。

其一，瀕危野生動物的拯救和保護。高度發達的工業文明也伴隨著地球人口的高速增長、資源消耗的持續增加和生態環境的不斷惡化，出現了人類和動物對資源利用和生存環境的激烈競爭，再加上人類對野生動物的大規模捕殺，導致許多種野生動物瀕臨滅絕，如亞洲大象、東北虎、大熊貓、孟加拉虎、普氏野馬、狼等。

其二，動物遺傳資源或遺傳多樣性的保護。家畜品種和遺傳資源多樣性是人類從事動物育種和畜牧生產的基礎。但近半個世紀以來，由于過度追求家畜的高產，大規模地引進良種家畜，對生產性能不高的原始品種和地方良種形成了巨大的沖擊，再加上無計劃的雜交改良，使許多優秀的原始品種和地方良種種群急劇減少，基因庫不同程度的混雜，遺傳多樣性遭到破壞，陷于瀕臨絕境的危險，在我國這種情況似乎更為嚴重。

目前，世界上約有11%的鳥類、25%的哺乳動物和34%的魚類瀕臨滅絕。過去認為，一旦這些動物品種滅絕，遺傳資源丟失，再恢復種群是極為困難的，甚至是不可能的。

通過動物細胞工程技術可以挽救和保護這些瀕臨滅絕的動物。采用超低溫冷凍技術可長期保存動物的生殖細胞或早期胚胎，也可以保存動物的體細胞系。保存了一個細胞就相當于保存了一個個體。采用人工輸精或體外授精技術能有效地擴大動物群體的數量，我國在東北虎和大熊貓的人工繁殖方面采用該技術取得了成功。

采用體細胞克隆動物技術可挽救瀕臨滅絕的動物，甚至有可能恢復已遭滅絕的動物物種。該技術已成功地應用于野牛、灰狼和盤羊等野生動物的復制。

體細胞克隆動物技術尤其適用于已失去生殖能力而又無繁殖群體的動物種群的恢復，也適用于雜交不育的動物（如騾子）的再生或群體的建立，2003年美國成功地用騾子的體細胞為核供體，以馬的卵母細胞為核受體，以馬為代孕母親，克隆出世界第一頭騾子。

將動物細胞工程的各項技術結合起來使用是拯救瀕危動物和保護動物遺傳資源的重要手段。但拯救瀕危野生動物的制約因素是受體的缺乏（如大熊貓可通過異質克隆構建克隆胚，即用大熊貓的體細胞和兔或其他動物的卵母細胞制備異構克隆胚，可是目前尚沒有合適的代孕受體），使這項技術只能停留在實驗室。所以，胚胎的受體是未來開展異質克隆的研究重點。

（四）生命科學基礎研究

動物生殖細胞工程學是在生命科學發展的基礎上誕生的，但它又是生命科學基礎研究的重要手段，反過來促進了生命科學基礎理論和技術的發展。

利用體外成熟、體外授精、體外發育和胚胎移植等技術研究動物配子發生和早期胚胎發生的過程、著床及免疫調控機理，在體外條件下，已發現若干調節胚胎發育的基因或蛋白。

利用干細胞體外培養和誘導分化技術研究細胞的分化行為和分化機理及其調控信號網絡。利用動物克?。òó愘|克隆技術）研究細胞周期、細胞核與細胞質的關系。利用動物轉基因技術可建立動物模型研究單一或復雜基因的功能和基因之間的關系，驗證基因的功能，研究基因或蛋白作用的網絡信號通路或分子機制，如通過轉入或剔除某一基因來認識其對相應性狀的影響。

研究人類某些疾病形成的相關基因及其效應，如人類常見的高血壓、糖尿病和地中海貧血等轉基因動物模型，已建立的人類遺傳疾病的轉基因動物模型已達幾十種。

20世紀80年代，用嵌合體（Chimera）技術誕生了綿羊和山羊的嵌合體個體，其外形具有綿羊和山羊的特征，也獲得了馬和斑馬的嵌合體。生殖細胞工程技術將在細胞生物學、生殖生物學、胚胎學、遺傳學、發育生物學、育種學甚至醫學的研究中扮演重要的角色。