第二節(jié)　性成熟和促性腺激素對(duì)小鼠卵母細(xì)胞體外發(fā)育能力的影響

一、引言

伴隨我國(guó)毛紡工業(yè)、乳品加工業(yè)以及高檔餐飲業(yè)等產(chǎn)業(yè)的高端化發(fā)展，高檔原材料的供給已成為制約相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸。目前，我國(guó)對(duì)一些重要經(jīng)濟(jì)品種的需求十分迫切，如產(chǎn)毛直徑在17μm以下的超細(xì)毛羊、產(chǎn)奶量達(dá)12t以上的超高產(chǎn)奶牛，以及肉用價(jià)值極高的和牛、韓牛等，但這些品種資源均被相關(guān)國(guó)家視為“國(guó)寶”，并作為戰(zhàn)略資源加以保護(hù)，限制種質(zhì)資源外流。目前國(guó)內(nèi)已初步建立了相關(guān)經(jīng)濟(jì)品種的種群，但數(shù)量極其有限。由于自然繁殖速度慢，采用人工授精、胚胎移植等常規(guī)擴(kuò)繁技術(shù)，建立一個(gè)2000只的純種羊群，至少要10年。利用幼畜卵母細(xì)胞體外受精、胚胎移植能夠大大縮短世代間隔，盡管性成熟前動(dòng)物卵母細(xì)胞體外成熟、受精后已經(jīng)產(chǎn)生后代（Revel等，1995；O’Brien等，1997，Khatir等，1998a；Ptak等，1999），但性成熟前動(dòng)物卵母細(xì)胞發(fā)育能力差，獲得的囊胚移植后獲得后代的比例比較低，胎兒死亡的原因不得而知（Seidel等，1971；Pinkert等，1989；Eppig等，1992；Revel等，1995；Damiani等，1996；Khatir等，1996；O’Brien等，1996；Izquierdo等，1999；Wu等，2007）。我們以小鼠為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛷募?xì)胞和分子水平研究性成熟前后動(dòng)物卵母細(xì)胞體外發(fā)育能力問(wèn)題，并尋找改善卵母細(xì)胞發(fā)育能力的方法。

（一）卵母細(xì)胞的成熟

在討論卵母細(xì)胞發(fā)育能力前，先闡述卵母細(xì)胞的生成和成熟過(guò)程。對(duì)于小鼠來(lái)講，卵子生成始于第8天胚胎的原生殖細(xì)胞，之后從胚外中胚層遷移到后腸后部?jī)?nèi)胚層，胚胎生成的第12天，原生殖細(xì)胞遷移完全，到達(dá)生殖嵴，這時(shí)與周圍體細(xì)胞很快建立密切的關(guān)系，發(fā)育為卵原細(xì)胞。隨著一系列有絲分裂過(guò)程，大部分卵原細(xì)胞分化為初級(jí)卵母細(xì)胞，并進(jìn)入第1次減數(shù)分裂前期，胚胎生成的第16天，幾乎所有的卵母細(xì)胞進(jìn)入粗線期，第18天進(jìn)入雙線期。分娩時(shí)，一些卵母細(xì)胞進(jìn)入晚期雙線期，雙線期的卵母細(xì)胞在生長(zhǎng)和分化過(guò)程中不斷地進(jìn)行物質(zhì)積累、核定位（Mitra and Schultz，1996）及細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的翻譯和翻譯后修飾作用（de Vantery等，1996）。在不同動(dòng)物，卵母細(xì)胞在這一時(shí)期休止數(shù)日至數(shù)年不等，出生5天后的小鼠，幾乎所有的卵母細(xì)胞均處于核網(wǎng)期。很快，這些卵母細(xì)胞被一層扁平上皮細(xì)胞包圍，成為原始卵泡。卵泡不斷生長(zhǎng)，但卵母細(xì)胞仍處于GV期，一直到性成熟前。性成熟后，在體內(nèi)排卵前促性腺激素峰的作用下開始恢復(fù)減數(shù)分裂，形成兩個(gè)一大一小單倍體細(xì)胞，經(jīng)過(guò)類似間期的短暫停頓，不進(jìn)行DNA合成，次級(jí)卵母細(xì)胞即進(jìn)入第2次減數(shù)分裂。第2次成熟分裂后，由卵泡中釋放到輸卵管中并接受精子入卵，然后釋放第二極體。

卵母細(xì)胞成熟涉及到細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、透明帶和卵丘細(xì)胞成熟的一個(gè)復(fù)雜的生理過(guò)程，核成熟是處于GV期的初級(jí)卵母細(xì)胞在MPF等多種因子與激素的作用下重新啟動(dòng)減數(shù)分裂，經(jīng)過(guò)GVBD、MⅠ期后，停滯于MⅡ期。細(xì)胞質(zhì)發(fā)生的變化包括，RNAs及蛋白質(zhì)合成，線粒體數(shù)量增加，并由近核區(qū)移向質(zhì)膜下區(qū)，在一端出現(xiàn)大空泡，即帽狀線粒體，卵母細(xì)胞的皮質(zhì)顆粒數(shù)量增加，到達(dá)MⅡ期時(shí)，CGs沿質(zhì)膜下呈線狀排列，核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、營(yíng)養(yǎng)性包涵物的數(shù)量都在增加；縫隙連接數(shù)量也增加，通過(guò)微絨毛連接與外周卵丘細(xì)胞聯(lián)系，分泌卵丘擴(kuò)展因子；細(xì)胞核的成熟使卵母細(xì)胞能夠獲得減數(shù)分裂的能力，細(xì)胞質(zhì)成熟是為卵母細(xì)胞激活、原核形成、附植前的胚胎發(fā)育做準(zhǔn)備。細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)都成熟才能保證正常的受精和胚胎發(fā)育。

1.卵母細(xì)胞的體外成熟

成年動(dòng)物每次發(fā)情周期，卵巢中約有500～1000個(gè)初級(jí)卵母細(xì)胞在促性腺激素或其他因子的作用下恢復(fù)減數(shù)分裂，發(fā)生生發(fā)泡破裂（Germinal Vesicle Breakdown，GVBD），排出第一極體，并發(fā)育到第2次減數(shù)分裂中期（MⅡ），成為成熟卵母細(xì)胞。成熟卵母細(xì)胞由極少數(shù)優(yōu)勢(shì)卵泡發(fā)育而成，在卵泡發(fā)育過(guò)程中絕大部分卵泡閉鎖退化，到排卵時(shí)只有一個(gè)、幾個(gè)或十幾個(gè)（豬和犬等）。采用卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)，開發(fā)利用未成熟卵泡，成倍增加雌性動(dòng)物遺傳資源的利用效率，也為其他胚胎工程技術(shù)研究和體外生產(chǎn)胚胎提供充足的卵母細(xì)胞。

卵母細(xì)胞在體內(nèi)成熟時(shí)，卵泡內(nèi)環(huán)境抑制卵母細(xì)胞的核成熟，使得核成熟和胞質(zhì)成熟之間存在最佳平衡，使核質(zhì)成熟同步化（Nogueira等，2003）；但在體外培養(yǎng)時(shí)，卵母細(xì)胞離開了卵泡的抑制環(huán)境，細(xì)胞核成熟的完成并不能保證細(xì)胞質(zhì)的完全成熟。體外成熟卵母細(xì)胞獲得的胚胎經(jīng)移植后，其胎兒出生率較體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞獲得的胎兒出生率低得多，自小腔卵泡中獲得的卵母細(xì)胞雖然已完成了細(xì)胞核成熟，即排出第一極體并發(fā)育到MⅡ期，但不能夠受精，即使受精后也很難發(fā)育到囊胚期；而大腔卵泡中的卵母細(xì)胞既能完成細(xì)胞核成熟，又能支持胚胎發(fā)育到囊胚階段（Eppig等，1994；Crozet等，1995）。這些現(xiàn)象可能與體外成熟的卵母細(xì)胞胞質(zhì)成熟程度欠佳有關(guān)（Eppig等，1998）。近年來(lái)，人們應(yīng)用多種方法改善卵母細(xì)胞體外細(xì)胞質(zhì)成熟，包括卵丘細(xì)胞共培養(yǎng)（Ge Li等，2008），改善成熟培養(yǎng)液成分，如加入抑制卵母細(xì)胞核過(guò)早成熟的物質(zhì)，使核質(zhì)成熟同步化，加入生長(zhǎng)因子、促性腺激素、能量物質(zhì)，還有能夠促進(jìn)卵母細(xì)胞GSH合成的半胱胺酸和胱氨酸等。

2.動(dòng)物年齡對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟的影響

同一種動(dòng)物在不同年齡段其卵母細(xì)胞體外成熟的情況有所不同。雖然性成熟前動(dòng)物有腔卵泡卵母細(xì)胞能夠恢復(fù)減數(shù)分裂，形成紡錘體，排出第一極體，到達(dá)第2次減數(shù)分裂中期的比例和成年動(dòng)物沒有差別（O’Brien等，1996；Ledda等，1997；Wu等，2007），但細(xì)胞質(zhì)成熟卻存在差異，具體表現(xiàn)在囊胚發(fā)育率降低、胚胎移植后胎兒存活率低（O’Brien等，1996；Ledda等，1997；Ptak等，1999）。例如，性成熟前山羊卵母細(xì)胞，盡管有高比例的核成熟率（72%），但得到的囊胚率卻很低（＜10%），這些都?xì)w因于細(xì)胞質(zhì)成熟異常和不完全。有報(bào)道表明，性成熟前動(dòng)物卵母細(xì)胞代謝谷氨酸鹽和丙酮酸鹽速率比成年動(dòng)物卵母細(xì)胞慢，卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程中mRNA、蛋白質(zhì)合成、氨基酸吸收、能量代謝、MPF、MAPK活性都比成年動(dòng)物低，卵丘細(xì)胞和卵母細(xì)胞之間縫隙連接數(shù)量少，卵母細(xì)胞周圍的卵丘細(xì)胞層數(shù)也影響卵母細(xì)胞成熟（譚景和等，1989）。性成熟前后卵母細(xì)胞直徑不同，幼年動(dòng)物卵母細(xì)胞直徑小；體外成熟后，幼年動(dòng)物卵母細(xì)胞皮質(zhì)顆粒遷移不完全，多精受精的比例高（O’Brien等，1997；Luderer等，2001），最終導(dǎo)致卵母細(xì)胞發(fā)育能力差。

（二）影響卵母細(xì)胞體外發(fā)育的因素

卵母細(xì)胞發(fā)育能力是指卵母細(xì)胞成熟、受精后發(fā)育到胚胎特定時(shí)期的能力，隨著胚胎生物技術(shù)在家畜繁育和人類輔助生殖領(lǐng)域的應(yīng)用，人們對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育能力給予了廣泛的關(guān)注。本書主要研究卵母細(xì)胞經(jīng)體外受精后發(fā)育到早期囊胚的能力。許多報(bào)道表明卵泡、卵母細(xì)胞大小，卵母細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，卵母細(xì)胞周圍的卵丘細(xì)胞數(shù)，卵母細(xì)胞所在的卵泡微環(huán)境，卵母細(xì)胞蛋白和RNA合成，體外成熟培養(yǎng)系統(tǒng)，對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育能力都有影響。因此本書就這些方面研究性成熟前后卵母細(xì)胞體外發(fā)育能力之間的差別，并尋找改善發(fā)育能力的方法。

1.動(dòng)物年齡對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育能力的影響

初情期是雌性動(dòng)物初次發(fā)情和排卵的時(shí)期，是性成熟的初級(jí)階段，是具有繁殖能力的開始。初情期以前，雌性動(dòng)物的生殖道和卵巢增長(zhǎng)緩慢。隨著雌性動(dòng)物年齡的增長(zhǎng)逐漸，當(dāng)達(dá)到一定年齡和體重時(shí)，即出現(xiàn)第1次發(fā)情和排卵。在初情期前，卵巢也有生長(zhǎng)卵泡，但后來(lái)退化閉鎖而消失，新的生長(zhǎng)卵泡又再出現(xiàn)，最后又再退化，如此反復(fù)進(jìn)行，直到初情期開始，卵泡才能生長(zhǎng)成熟以至排卵。性的成熟是一個(gè)過(guò)程，概念上與初情期有所不同，但有時(shí)兩者混用。可以把“性成熟”理解為生殖機(jī)能發(fā)育的某一特定時(shí)期，它是在初情期后的較晚時(shí)候，亦即生殖機(jī)能達(dá)到了比較成熟的階段。此時(shí)生殖器官已發(fā)育完全，具備了正常的繁殖能力。但此時(shí)身體的生長(zhǎng)發(fā)育尚未完成，故一般種畜不宜配種，以免影響雌性動(dòng)物本身和胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育。利用幼畜體外成熟卵母細(xì)胞能夠最大限度地縮短世代間隔，加速品種改良。然而，性成熟前動(dòng)物卵母細(xì)胞發(fā)育能力比成年動(dòng)物差在多種動(dòng)物中都得到了證明（cattle：Revel F，1995；Damiani P，M R D，1995；Khatir H，M R D，1996；sheep：O’Brien J K，1996；Ledda S，1997；pig：Pinkert C A，J Reprod Fertil，1989；goat：Izquierdo D，Theriogenology，1999）。但也有一些研究認(rèn)為和成年動(dòng)物卵母細(xì)胞發(fā)育能力沒有差別（Armstrong D T，1992；Irvin B，1993）。性成熟前牛和綿羊卵母細(xì)胞作為供體已經(jīng)出生了后代（Revel等，1995；O’Brien等，1997；Khatir等，1998a；Ptak等，1999）。然而，體外成熟的性成熟前牛（Revel等，1995）、山羊（Martino等，1995）、豬（Pinkert等，1989）、綿羊（Ledda等，1997）卵母細(xì)胞發(fā)育能力都低于成年動(dòng)物。Eppig and Schroeder（1987）證明，卵母細(xì)胞發(fā)育能力隨著日齡的增加而增強(qiáng)。

2.促性腺激素對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育能力的影響

卵母細(xì)胞所在的卵泡環(huán)境直接影響體外成熟卵母細(xì)胞的發(fā)育能力，所以多年來(lái)人們一直探索如何操縱卵泡發(fā)育以提高卵母細(xì)胞的發(fā)育能力。在卵泡發(fā)育過(guò)程中，促性腺激素發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。所以最常用的方法就是在收集卵母細(xì)胞前用促性腺激素處理卵巢，通過(guò)調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育調(diào)節(jié)體外成熟卵母細(xì)胞的發(fā)育能力。然而，促性腺激素對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育能力的影響還存在爭(zhēng)議，不同實(shí)驗(yàn)室得到的結(jié)果不盡相同。激素處理能夠提高性成熟前卵母細(xì)胞發(fā)育能力在多種動(dòng)物上得到了證明（mouse：Eppig J J等，1994；rat：Zhang等，1989；sheep：Pugh等，1991；cow：Lu等，1991；Grazyna Ptak等，2003），也有一些人認(rèn)為激素處理沒有作用。一些研究認(rèn)為，激素能提高卵母細(xì)胞發(fā)育能力（Armstrong等，1991），一些研究認(rèn)為會(huì)降低卵母細(xì)胞發(fā)育能力（Moor等，1985）。促性腺激素能夠引起卵泡顆粒細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)LHR的合成和類固醇生成酶的表達(dá)，調(diào)節(jié)卵泡內(nèi)的激素微環(huán)境。促性腺激素提高卵母細(xì)胞發(fā)育能力，是通過(guò)產(chǎn)生的一些因子通過(guò)細(xì)胞-細(xì)胞偶聯(lián)途徑導(dǎo)致卵母細(xì)胞的生理變化。促性腺激素受體在卵泡細(xì)胞中表達(dá)，因此，激素作用于卵泡細(xì)胞誘導(dǎo)信號(hào)，通過(guò)縫隙連接傳遞給卵母細(xì)胞，也有人證明激素能夠直接作用于卵母細(xì)胞，因?yàn)樵趥}(cāng)鼠的卵母細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)了促性腺激素受體。Wang等（1997）對(duì)促排卵和未促排卵的IVM卵母細(xì)胞進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用促排卵周期患者的獲卵率和達(dá)到第2次減數(shù)分裂中期（MⅡ期）卵母細(xì)胞的數(shù)量，明顯高于未應(yīng)用促排卵周期的患者。超排獲得的卵母細(xì)胞與自然周期獲得的卵母細(xì)胞在發(fā)育能力上存在差異（Bing等，2002）。

注射FSH可以通過(guò)抑制顆粒細(xì)胞凋亡來(lái)挽救自然周期卵巢卵泡發(fā)生期間將要發(fā)生閉鎖的卵泡（Fukushima等，1985；王海濱等，2000）。FSH暫時(shí)抑制GVBD，改變第一次成熟分裂所需的時(shí)間，促進(jìn)卵母細(xì)胞的成熟。FSH經(jīng)常與LH協(xié)同使用。FSH促進(jìn)卵丘細(xì)胞分泌E2，而E2又可直接作用于卵母細(xì)胞（有E2受體）（Fukushima等，1985），調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞成熟和鈣離子儲(chǔ)存。還可能通過(guò)提高卵母細(xì)胞內(nèi)在質(zhì)量直接提高卵母細(xì)胞的發(fā)育能力。激素處理后SN卵母細(xì)胞的比例顯著提高。小鼠卵母細(xì)胞生長(zhǎng)通常在卵泡腔形成時(shí)結(jié)束，卵母細(xì)胞由轉(zhuǎn)錄活躍狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)檗D(zhuǎn)錄靜止?fàn)顟B(tài)，染色質(zhì)也有彌散，非環(huán)繞核仁構(gòu)型（NSN）轉(zhuǎn)變?yōu)橹旅堋h(huán)繞型核仁（SN）（Mattioli等，1988）。研究證實(shí)，這種轉(zhuǎn)變與卵母細(xì)胞獲得發(fā)育能力密切相關(guān)。SN構(gòu)型卵母細(xì)胞的GVBD和成熟至MⅡ期的能力都明顯高于NSN型卵母細(xì)胞，成熟受精后SN卵母細(xì)胞能發(fā)育到囊胚，但是NSN型卵母細(xì)胞發(fā)育則很少能超過(guò)2-細(xì)胞（Zuelke，1997）。Vandenhyden等（1990）研究表明FSH可以延緩卵母細(xì)胞核成熟，使細(xì)胞質(zhì)成熟完全。卵母細(xì)胞細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)成熟是相互獨(dú)立的過(guò)程，但是兩者需要保持同步才能保證卵母細(xì)胞較高的發(fā)育能力。

促性腺激素對(duì)性成熟前動(dòng)物卵母細(xì)胞發(fā)育能力的影響已經(jīng)有了一些研究。性成熟前動(dòng)物處理促性腺激素后卵泡得到了生長(zhǎng)，改善了卵母細(xì)胞發(fā)育能力。O’Brien等（1996）的實(shí)驗(yàn)表明，注射促性腺激素的4～6月齡的性成熟前小羊，細(xì)胞質(zhì)中線粒體和皮質(zhì)顆粒的數(shù)量增加。Wu等（2007）的研究表明，性成熟前后小鼠卵母細(xì)胞發(fā)育能力有差別，注射促性腺激素后改善了性成熟前后卵母細(xì)胞發(fā)育能力，囊胚發(fā)育率幼鼠和成年鼠沒有差別。Tsafriri等的結(jié)果證明，F(xiàn)SH處理的性成熟前后卵母細(xì)胞核成熟比例和精子穿透比例沒有差別，但是成年山羊卵母細(xì)胞比性成熟前山羊卵母細(xì)胞的正常受精比例高（49% vs.24%）。然而，這一結(jié)論是由于FSH激素引起的還是由于供體年齡引起的未作研究。另外，Ledda等（1997），O’Brien等，（1997）表明注射促性腺激素的性成熟前羊卵母細(xì)胞發(fā)育能力低于成年羊，而Earl等的結(jié)論與之相反，加入促性腺激素處理的山羊顆粒細(xì)胞對(duì)性成熟前卵母細(xì)胞發(fā)育能力有促進(jìn)作用，顆粒細(xì)胞作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生一些信號(hào)，促進(jìn)卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)成熟。激素處理的山羊卵泡大，大直徑卵泡卵母細(xì)胞發(fā)育能力好于小卵泡，因此來(lái)源于大卵泡的顆粒細(xì)胞培養(yǎng)的卵母細(xì)胞發(fā)育能力好于小卵泡。

另有一些研究認(rèn)為胚胎早期發(fā)育所需的mRNA及蛋白需要卵母細(xì)胞積累，由于激素刺激使排卵過(guò)早，卵母細(xì)胞內(nèi)mRNA及蛋白水平必然受到影響。超排激素的使用可能導(dǎo)致卵巢過(guò)度刺激以及卵母細(xì)胞染色體的畸形。人類正常生理周期排出的卵母細(xì)胞與超排獲得的卵母細(xì)胞在基因及蛋白水平上存在差異。另有報(bào)道表明，與自然周期的小鼠比較，超排鼠體內(nèi)囊胚表明微絨毛少，［³⁵S］-蛋氨酸吸收低，細(xì)胞數(shù)少。

這些研究結(jié)論存在一些矛盾可能是因?yàn)檫x擇動(dòng)物的供體年齡、繁殖季節(jié)、飼養(yǎng)管理和激素處理方法不同。處理促性腺激素增加了性成熟前動(dòng)物大的有腔卵泡的數(shù)量，增加了卵母細(xì)胞的數(shù)量，為胚胎體外生產(chǎn)提供了來(lái)源。因此，我們需要進(jìn)一步了解性成熟前動(dòng)物卵母細(xì)胞成熟機(jī)制，優(yōu)化培養(yǎng)條件和促性腺激素的處理方法，提高這些卵母細(xì)胞的發(fā)育能力。

3.多精子受精對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育能力的影響

卵母細(xì)胞受精后，精子細(xì)胞核膨大，核膜呈泡狀，進(jìn)而核膜破裂，染色質(zhì)分散到卵子細(xì)胞質(zhì)中，而且精子的染色質(zhì)也從致密狀態(tài)開始松散成為顆粒狀或細(xì)絲狀，隨后泡狀的核膜在分散的染色質(zhì)周圍集中形成許多小囊，這些小囊相互合并組成一雙層結(jié)構(gòu)的核膜，形成雄原核。與此同時(shí)，卵母細(xì)胞完成第2次減數(shù)分裂，染色質(zhì)首先分散，沿著分散的染色質(zhì)邊緣匯集了一些小囊，它們也逐漸融合形成一雙層包膜，從而形成了一些內(nèi)含染色質(zhì)的小囊，稱為染色質(zhì)泡。隨后這些小泡互相接近，包膜彼此合并形成一個(gè)形狀不規(guī)則的雌原核。雌雄原核逐漸移向卵子的中央，實(shí)現(xiàn)融合，染色體彼此聚攏在一起，使配子的單倍體恢復(fù)成為合子的雙倍體，完成遺傳物質(zhì)的重組。

精子進(jìn)入卵母細(xì)胞后，卵母細(xì)胞中形成雄原核生長(zhǎng)因子（MPGF），MPGF可能是像核質(zhì)素（nucleoplasmin）一樣的物質(zhì)，是精核去致密所必需的。維持雌、雄原核形成所必需的物質(zhì)，其數(shù)量是有限的，當(dāng)精子進(jìn)入卵中之后，精核和卵核則競(jìng)相爭(zhēng)奪這種原核形成物質(zhì)。在小鼠和大鼠，精核比卵原核對(duì)原核形成物質(zhì)具有更大的親和力，因此，雄原核比雌原核大，但其他動(dòng)物則不是這樣。多精子進(jìn)入卵母細(xì)胞后，同時(shí)競(jìng)爭(zhēng)原核形成物質(zhì)，使原核直徑變小。原核直徑和卵母細(xì)胞發(fā)育能力具有相關(guān)性（Payne等，1997），可以用來(lái)判定體外受精后胚胎質(zhì)量及發(fā)育潛力。

哺乳動(dòng)物是單精受精動(dòng)物，受精時(shí)只需一個(gè)精子入卵，以保證合子重新恢復(fù)二倍體。如果有一個(gè)以上精子入卵，通常會(huì)導(dǎo)致胚胎發(fā)育異常或發(fā)育阻滯，最終夭折。影響多精受精的因素包括以下幾個(gè)方面。

（1）卵母細(xì)胞成熟程度　與成熟的卵母細(xì)胞相比，未成熟卵由于不能發(fā)生完善的皮質(zhì)反應(yīng)和透明帶反應(yīng)而呈現(xiàn)較高的多精受精率（Niwa K等，1991；Wang等，1992）。用未成熟卵子受精時(shí)，精子的穿入并不能使卵子釋放皮質(zhì)顆粒（CGs）（Wang W H等，1997a；Wang W H等，1997b）。未成熟卵子的多精受精可能與以下幾個(gè)方面有關(guān)：精子穿入未成熟卵子時(shí)引起的鈣顫不明顯，即使直接向卵內(nèi)注射鈣或1，4，5-三磷酸肌醇（IP3）也難以奏效（Machaty等，1997；Mehlmann等，1994）；CGs在質(zhì)膜下的分布不均勻；未成熟卵中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的數(shù)目較少（Mehlmann等，1994），內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是儲(chǔ)存鈣的細(xì)胞器之一；未成熟卵上IP3受體的數(shù)目較少，致使卵子對(duì)相應(yīng)激活因子的刺激不敏感（Mehlmann等，1996）。

（2）透明帶異常　透明帶主要由ZP1、ZP2、ZP3等糖蛋白構(gòu)成。卵子激活時(shí)釋放到卵周隙（PVS）的CGs內(nèi)容物使透明帶發(fā)生了某些改變，從而阻止了以后精子的穿越（Bauskin等，1999）。多精受精且形成多原核的受精卵，其透明帶內(nèi)層有微細(xì)的間斷（Keefe等，1997）。

（3）卵泡細(xì)胞的作用　卵丘細(xì)胞和顆粒細(xì)胞上的特有成分能夠促進(jìn)精子獲能和發(fā)生頂體反應(yīng)。將卵丘細(xì)胞和顆粒細(xì)胞在體外培養(yǎng)36h或48h，再將其凍融后加入到IVF液中，可顯著地提高精子入卵率，而降低多精受精率（Wang等，1992）。在進(jìn)行IVF操作時(shí)，如果在卵母細(xì)胞上保留一定數(shù)量的卵丘細(xì)胞和放射冠細(xì)胞，則可明顯提高雄原核（MPN）的形成率。如果在IVM時(shí)將卵母細(xì)胞與卵泡細(xì)胞共培養(yǎng)，則可提高卵母細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的含量和受精后囊胚發(fā)育率（Abeydeera等，1998）。

阻止多精受精的機(jī)制主要有兩條，一是雌性生殖道的初步篩選，盡管哺乳動(dòng)物一次射出的精子很多，但能到達(dá)受精部位的精子卻很少，只有那些活力相當(dāng)好的精子才能到達(dá)受精部位；二是卵子本身所具有的阻止多精受精的能力，卵母細(xì)胞的皮質(zhì)顆粒在阻止多精受精中發(fā)揮重要的作用。

皮質(zhì)顆粒是哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞中的一種圓形的外包界膜的細(xì)胞器，許多作者認(rèn)為來(lái)自高爾基復(fù)合體，也有作者在小鼠、山羊及牛卵母細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，皮質(zhì)顆粒的發(fā)生與滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)關(guān)系更為密切，其實(shí)歸根到底都是一個(gè)起源，因?yàn)楦郀柣w來(lái)自滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。皮質(zhì)顆粒直徑一般在0.2～0.6μm，內(nèi)含不同電子致密度的、均質(zhì)的內(nèi)容物。原始卵泡中的卵母細(xì)胞通常不含皮質(zhì)顆粒，卵泡開始生長(zhǎng)以后，皮質(zhì)顆粒才開始形成，在不同動(dòng)物出現(xiàn)的時(shí)間不同，在小鼠和大鼠中，由單層卵泡細(xì)胞包圍的初級(jí)卵泡的卵母細(xì)胞中就出現(xiàn)皮質(zhì)顆粒；在牛中，由兩層以上卵泡細(xì)胞包圍的卵母細(xì)胞中出現(xiàn)皮質(zhì)顆粒（譚景和等，1992）；人及兔卵母細(xì)胞皮質(zhì)顆粒在次級(jí)卵泡階段出現(xiàn)（Cran等，1985）。隨著卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)，皮質(zhì)顆粒的數(shù)量不斷增加。

近年來(lái)，人們以熒光素標(biāo)記的植物凝集素為分子探針、利用激光共聚集顯微術(shù)研究了一些哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中CGs遷移和重分布情況（Byers等，1992；Yoshida等，1993；Wang等，1997；Carneiro等，2002；Velilla等，2004）。研究結(jié)果表明，多數(shù)哺乳動(dòng)物，GV期卵母細(xì)胞的CGs分布在整個(gè)皮質(zhì)胞質(zhì)。卵母細(xì)胞不論是在體內(nèi)成熟還是在體外成熟期間，均發(fā)生皮質(zhì)顆粒向皮質(zhì)遷移，當(dāng)卵母細(xì)胞完成核成熟、到達(dá)MⅡ期時(shí)，CGs沿質(zhì)膜下呈線狀排列，有些物種卵母細(xì)胞內(nèi)CGs的分布存在明顯的極性，第2次減數(shù)分裂紡錘體所在的區(qū)域，其質(zhì)膜下沒有CGs，這個(gè)區(qū)域被稱為無(wú)CGs區(qū)（cortical granules-free domain，CGFD）。在小鼠，CGFD約占整個(gè)卵子表面的40%，且該區(qū)域常無(wú)微絨毛分布（譚景和等，1995）。精子入卵后，激發(fā)卵質(zhì)膜下的皮質(zhì)顆粒發(fā)生胞吐（或稱皮質(zhì)反應(yīng)），從精子入卵點(diǎn)開始向四周擴(kuò)散，外排的皮質(zhì)顆粒內(nèi)容物中含有蛋白酶或糖苷酶，可溶解透明帶ZP₃（糖蛋白）而阻止多余精子與透明帶相結(jié)合，避免多精受精的發(fā)生（譚景和，《脊椎動(dòng)物比較胚胎學(xué)》）。精卵結(jié)合時(shí)卵母細(xì)胞被激活，CGs釋放并與質(zhì)膜融合發(fā)生胞吐，引起皮質(zhì)反應(yīng)。胞吐到卵周隙的酶類引起透明帶糖蛋白結(jié)構(gòu)的改變，阻止了因其他精子再次穿卵而產(chǎn)生的多精入卵，這稱為透明帶反應(yīng)。近年來(lái)，卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中皮質(zhì)顆粒遷移及在皮質(zhì)區(qū)的重新分布作為判斷卵母細(xì)胞胞質(zhì)成熟的一個(gè)指標(biāo)為越來(lái)越多的研究者所接受（Velilla等，2004）。

目前認(rèn)為，影響卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中CGs遷移和重分布的因素主要有（Liu等，2005）：生發(fā)泡破裂（GVBD）是否發(fā)生；細(xì)胞骨架；卵丘細(xì)胞；體外成熟培養(yǎng)液成分。1998年，Connors等用dbcAMP抑制小鼠卵母細(xì)胞GVBD的發(fā)生，結(jié)果CGFD不能形成，說(shuō)明CGs在皮質(zhì)區(qū)的重分布需要GVBD。對(duì)豬（Kim等，1996；Sun等，2001a）和小鼠（Connor等，1998）的研究表明，微絲參與卵母細(xì)胞成熟期間CGs遷移和重新分布，在細(xì)胞松弛素D（cytochalasin D，CD）處理的卵母細(xì)胞中，MⅠ期紡錘體保留在卵母細(xì)胞中間，極體不能排出，CGs仍然停留在胞質(zhì)內(nèi)部，CGFD沒有形成；微管的破壞不影響CGs向皮質(zhì)區(qū)遷移，也不影響CGs重新分布。

許多研究結(jié)果表明，性成熟前動(dòng)物多精受精比例顯著高于成年動(dòng)物，導(dǎo)致體外胚胎發(fā)育能力下降，而皮質(zhì)顆粒在成熟過(guò)程中遷移不完全或提前發(fā)生胞吐是發(fā)生多精受精的重要原因，因此研究性成熟前動(dòng)物皮質(zhì)顆粒遷移情況，對(duì)于幼年動(dòng)物卵母細(xì)胞發(fā)育能力的研究有非常重要的意義。

4.卵泡直徑和卵母細(xì)胞直徑對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育能力的影響

哺乳動(dòng)物繁殖后代的首要事件就是卵泡發(fā)育（Spicer and Echternkamp，1986），即由休眠原始卵泡開始進(jìn)行生長(zhǎng)發(fā)育。在性成熟以前，原始卵泡一旦開始生長(zhǎng)，大多數(shù)卵泡就能夠發(fā)育到有腔卵泡期，但最終都發(fā)生閉鎖。性成熟以后，少數(shù)卵泡被促性腺激素挽救而繼續(xù)生長(zhǎng)（即周期性募集），經(jīng)過(guò)卵泡選擇和優(yōu)勢(shì)化以后，一個(gè)或數(shù)個(gè)卵泡發(fā)育成熟并排卵（Hirshfield 1991），其他99%以上進(jìn)入生長(zhǎng)群的卵泡發(fā)生閉鎖（Ireland，1987）。成熟卵泡的大小因物種不同而有所差異，一般牛卵泡達(dá)12～19mm、羊卵泡發(fā)育至5～8mm、豬卵泡直徑8～12mm、馬卵泡為25～4mm時(shí)即可視為成熟卵泡，此時(shí)由于卵泡腔擴(kuò)大顆粒細(xì)胞分裂增殖停止，而使顆粒細(xì)胞層變薄僅為2～3層（沈芬霞等，2000）。

卵母細(xì)胞發(fā)育能力是隨著卵泡和卵母細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育逐漸獲得的。在這一過(guò)程中，卵母細(xì)胞存儲(chǔ)RNA和蛋白質(zhì)，細(xì)胞核發(fā)生GVBD，染色質(zhì)凝集，第一極體排出，以及M-II抑制，卵胞質(zhì)發(fā)生細(xì)胞器重排、MAPK和MPF活性變化、Ca²⁺釋放機(jī)制等變化。卵泡直徑和卵母細(xì)胞直徑是衡量卵母細(xì)胞質(zhì)量的一個(gè)指標(biāo)，大卵泡獲得的卵母細(xì)胞發(fā)育能力顯著高于小卵泡（Furher等，1989），卵母細(xì)胞直徑越大，發(fā)育能力越強(qiáng)（mouse：Wu等，2007）。有報(bào)道表明，22天和26天小鼠卵母細(xì)胞發(fā)育能力有顯著差異，取相同大小的22天和26天小鼠卵母細(xì)胞體外受精后，26天小鼠卵母細(xì)胞發(fā)育能力顯著高于22天，這說(shuō)明卵母細(xì)胞獲得發(fā)育能力是與卵泡發(fā)育有關(guān)的。26天小鼠卵母細(xì)胞隨著直徑的增加發(fā)育能力增加（Eppig等，1992）。卵泡和卵母細(xì)胞發(fā)育同步化，反映顆粒細(xì)胞增殖程度和卵母細(xì)胞生長(zhǎng)同步化程度和能否用卵泡大小判斷卵母細(xì)胞發(fā)育能力。以前的報(bào)道表明豬和綿羊性成熟后卵泡細(xì)胞和卵母細(xì)胞發(fā)育才同步化（Grazyna Ptak等，2006），性成熟前羊卵母細(xì)胞和卵泡發(fā)育同步化沒有成年羊好（0.11vs.0.61）。在成年動(dòng)物中卵泡直徑和卵母細(xì)胞直徑相關(guān)（cattle：Fair等，1995；buffalo：Raghu等，2002），并且和發(fā)育能力有關(guān)（cattle：Furher等，1989）。觀察小牛和成年母牛卵母細(xì)胞體外成熟的幾項(xiàng)特征，發(fā)現(xiàn)小牛卵母細(xì)胞的平均直徑（118μm±1.15μm）比成年母牛的卵母細(xì)胞平均直徑（122.83μm±0.74μm）小。牛直徑為2～6mm的卵泡為體外培養(yǎng)最佳卵泡，小于2mm卵泡發(fā)育能力很低，卵泡卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂能力和胞質(zhì)成熟能力差；直徑大于6mm的卵母細(xì)胞其卵裂率及囊胚發(fā)育率顯著高于直徑2～6mm小卵泡卵。Pavlok實(shí)驗(yàn)證實(shí)，2～8mm之間卵泡卵母細(xì)胞有相似率及囊胚發(fā)育率，而小于2mm卵泡卵幾乎完全缺乏發(fā)育至囊胚的能力（Pavlok A等，1992；Lonergan P等，1994）。

5.卵丘細(xì)胞對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育能力的影響

卵母細(xì)胞的成熟發(fā)育與其周圍的卵泡細(xì)胞的作用是分不開的。卵泡細(xì)胞和卵母細(xì)胞伸出突起穿過(guò)透明帶互相聯(lián)系。在卵母細(xì)胞的成熟和受精過(guò)程中起著重要作用（Fukui and Sakuma，1980；Fukui and Ono，1989；Zhang等，1995）。卵母細(xì)胞在離開卵泡環(huán)境后能自發(fā)地恢復(fù)減數(shù)分裂，而細(xì)胞核成熟的完成并不能保證細(xì)胞質(zhì)的成熟，1990年Buccione等指出，卵母細(xì)胞與卵丘細(xì)胞之間的縫隙連接對(duì)卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)和減數(shù)分裂的維持非常重要，卵丘細(xì)胞中的cAMP能促進(jìn)成熟抑制因子的產(chǎn)生和激活，這些因子轉(zhuǎn)運(yùn)到卵母細(xì)胞，抑制或延遲卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)（Eppig and Downs，1984）。

同時(shí)，卵母細(xì)胞對(duì)卵丘細(xì)胞的擴(kuò)展也有調(diào)節(jié)作用（Buccione等，1990），而卵丘細(xì)胞的擴(kuò)展又影響卵母細(xì)胞的成熟。卵丘細(xì)胞的擴(kuò)展，可以使卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞間的縫隙連接數(shù)量減少或終止，從而導(dǎo)致由卵丘細(xì)胞向卵母細(xì)胞傳遞的卵母細(xì)胞成熟抑制物質(zhì)減少或消失，進(jìn)而引起卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)，卵母細(xì)胞對(duì)卵泡細(xì)胞甾類激素的合成和分泌也具有調(diào)節(jié)作用（Vanderhyden and Tonary，1989）。然而一些作者也證明成熟培養(yǎng)液中加入顆粒細(xì)胞對(duì)細(xì)胞質(zhì)成熟沒有作用。

卵丘細(xì)胞參與誘導(dǎo)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)，卵丘細(xì)胞在促性腺激素促進(jìn)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)的過(guò)程中起重要作用，可能的機(jī)制是，引發(fā)顆粒細(xì)胞來(lái)源的成熟誘導(dǎo)信號(hào)，克服卵泡的抑制環(huán)境；中斷卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞之間的縫隙連接。在成熟期間，卵丘卵母細(xì)胞之間的偶聯(lián)發(fā)生了動(dòng)力學(xué)上的變化，主要是卵丘細(xì)胞內(nèi)縫隙連接的丟失，它可能是通過(guò)中斷從外部卵丘細(xì)胞到卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂抑制信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)干涉卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的恢復(fù)（Eppig and Downs，1987）。

卵丘細(xì)胞能夠吸引、捕獲和選擇精子，增加圍繞在卵母細(xì)胞周圍的精子數(shù)目；卵丘細(xì)胞能夠在體外分泌蛋白質(zhì)，卵丘細(xì)胞也可能從輸卵管液和卵泡液中或從有血清的成熟培養(yǎng)液中捕獲蛋白質(zhì)提供給卵母細(xì)胞。可刺激精子的活力，推動(dòng)頂體反應(yīng)，使精子對(duì)透明帶反應(yīng)（Zona reaction）敏感，形成頂體反應(yīng)誘導(dǎo)配體，精子穿過(guò)卵丘基質(zhì)纖維網(wǎng)時(shí)，可以去掉其表面覆蓋物。另外一些功能包括，卵丘細(xì)胞產(chǎn)生的孕酮能夠促進(jìn)精子發(fā)生卵質(zhì)膜反應(yīng)；促進(jìn)延長(zhǎng)卵的壽命，減緩排卵后ZP的硬化，淘汰運(yùn)動(dòng)能力不強(qiáng)的精子。在卵成熟過(guò)程中，卵母細(xì)胞分泌旁分泌因子，與FSH協(xié)同作用，可以促使卵丘細(xì)胞分泌透明質(zhì)酸，從而促進(jìn)卵丘擴(kuò)展，有利于精子穿入卵丘。

卵母細(xì)胞和卵泡細(xì)胞相互作用是一個(gè)雙向的過(guò)程，卵泡環(huán)境決定卵母細(xì)胞發(fā)育能力，卵母細(xì)胞的旁分泌因子對(duì)卵泡的發(fā)育也有重要作用，在沒有卵母細(xì)胞的情況下，卵泡不能生長(zhǎng)和發(fā)育，卵母細(xì)胞對(duì)卵泡細(xì)胞發(fā)育的調(diào)節(jié)方面的研究始于將兔的卵母細(xì)胞去掉，卵泡細(xì)胞就發(fā)生黃體化。卵母細(xì)胞分泌的因子調(diào)節(jié)卵泡細(xì)胞的功能，包括卵丘細(xì)胞黏液化和透明質(zhì)酸的產(chǎn)生（Buccione等，1990）；細(xì)胞增殖，類固醇生成和抑制素的合成；urokinasetype plasminogen activator（uPA），促黃體激素受體的生成（LHR），and kit-ligand（KL）。卵母細(xì)胞分泌因子TGFβ包括TGFβ1、GDF-9和BMP-15，能夠模擬卵母細(xì)胞對(duì)卵泡細(xì)胞的作用，GDF-9、BMP-15缺乏的小鼠和綿羊卵泡發(fā)育不正常。

6.卵母細(xì)胞胞質(zhì)中GSH對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育能力的影響

谷胱甘肽是一種巰基三肽，全稱為γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸，是在哺乳動(dòng)物機(jī)體中廣泛分布的一種主要的非蛋白巰基復(fù)合物，體細(xì)胞和配子中均有存在。谷胱甘肽以兩種形態(tài)存在，即還原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG），但在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，約90%以上的GSH以還原型存在。在谷胱甘肽過(guò)氧化物酶類和谷胱甘肽還原酶類的作用下，GSH和GSSG發(fā)生相互轉(zhuǎn)化，同時(shí)與過(guò)氧化氫或其他有機(jī)氧化物反應(yīng)，從而起到解毒的作用。轉(zhuǎn)化分子式如下。

（1）卵母細(xì)胞胞質(zhì)中GSH的合成　在細(xì)胞中，半胱氨酸和谷氨酸在γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的作用下生成γ-谷氨酰半胱氨酸，其中半胱氨酸和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶分別是GSH合成的限速底物和限速酶。γ-谷氨酰半胱氨酸再與甘氨酸在GSH合成酶的作用下進(jìn)一步生成GSH（圖1-1）。

在許多低等有機(jī)體γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（GCL）是單獨(dú)的多肽，大多數(shù)真核生物GCL酶是異二聚體復(fù)合物（包括兩個(gè)不同基因的產(chǎn)物），催化亞基較大（GCLC 637 amino acids，approximately 73kDu），包含ATP依賴的結(jié)合半胱氨酸的氨基和谷氨酸的羧基的活性位點(diǎn)。調(diào)節(jié)亞基較小（GCLM 274 amino acids，approximately 31 kDu），通過(guò)直接與GCLC作用增加GCLC的催化效率。GCLM降低谷氨酸和ATP的K_m，增加GSH反饋抑制的K_i（Meister等，1983）。GSH競(jìng)爭(zhēng)性地抑制GCL，通過(guò)和谷氨酸競(jìng)爭(zhēng)GCLC的活性位點(diǎn)，GCLC有低的催化活性，催化半胱氨酸和谷氨酸結(jié)合形成γ-谷氨酰半胱氨酸，調(diào)節(jié)亞基沒有催化活性，但能與催化亞基結(jié)合，調(diào)節(jié)催化亞基的催化效率（Huang等，1993）。GCLM通過(guò)降低GSH的反饋抑制調(diào)節(jié)酶的活性（Huang等，1993），正常生理?xiàng)l件下，GSH的合成受兩個(gè)因素影響——半胱氨酸的利用和GCL活性，細(xì)胞培養(yǎng)液中半胱氨酸迅速氧化成胱氨酸，進(jìn)入細(xì)胞后，迅速被還原為半胱氨酸。有報(bào)道表明，添加BSO（抑制GCL活性）能顯著降低谷胱甘肽的合成，增加了顆粒細(xì)胞凋亡和卵母細(xì)胞碎裂。正常生理?xiàng)l件下，GCLC沒有催化活性，和Gclm結(jié)合才起作用。調(diào)節(jié)GCL的兩個(gè)亞基基因表達(dá)，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)GSH的合成。在卵巢中健康卵泡Gclm表達(dá)水平高，而閉鎖卵泡Gclm表達(dá)量低，排卵前促性腺激素刺激使得膜細(xì)胞Gclm顯著增加，促性腺素處理后GCLC和Gclm水平增加，GCL酶活性增加，使得卵巢GSH合成顯著增加（Luderer等，2001）。

（2）GSH在卵母細(xì)胞成熟、受精及早期胚胎發(fā)育過(guò)程中的作用　細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的合成是卵母細(xì)胞胞質(zhì)成熟過(guò)程中的一個(gè)重要部分。許多學(xué)者認(rèn)為卵母細(xì)胞體外成熟后GSH的含量是卵母細(xì)胞胞質(zhì)成熟的有效標(biāo)示之一（Abeydeera等，1998；de Matos等，1997；de Matos等，2000）。可見，GSH在卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。

①使細(xì)胞免受自由基和代謝產(chǎn)生的氧化型中間產(chǎn)物（如過(guò)氧化物）的氧化損傷（Meister等，1983）。

a. GSH作為輔酶，通過(guò)調(diào)節(jié)氧化還原反應(yīng)，調(diào)節(jié)蛋白和DNA合成。GSH能夠保護(hù)紡錘體免受氧化損傷，以維持減數(shù)分裂紡錘體正常的形態(tài)和功能，確保正常的合子形成。

b. GSH能夠維持配子細(xì)胞膜的穩(wěn)定。細(xì)胞外的GSH能夠清除培養(yǎng)液等細(xì)胞外環(huán)境中的ROS，從而抑制配子細(xì)胞膜上的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，防止細(xì)胞外物質(zhì)對(duì)配子的損傷（Brad等，2003）。

c. GSH保護(hù)蛋白質(zhì)免受氧化損傷。GSH能夠與配子細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)合成混合的二硫化物（蛋白質(zhì)-S-S-谷胱甘肽），從而起到保護(hù)蛋白質(zhì)的作用（Bernard等，1995）。

②GSH參與精子染色體解凝、卵母細(xì)胞激活、雄原核形成等過(guò)程。GSH參與倉(cāng)鼠（Perreault等，1988）、豬（Yoshida等，1993）和牛等動(dòng)物的受精和雄原核形成。GSH提供啟動(dòng)雄原核形成之前染色質(zhì)解凝聚所需的還原基團(tuán)。精子染色體解凝是雄原核形成的第一步，而精子染色體的解凝需要精子染色體中的二硫鍵的還原來(lái)誘導(dǎo)。GSH是精子內(nèi)重要的巰基，是二硫鍵還原的重要影響因素。

③GSH參與氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成。Meister首先提出了γ-谷氨酰循環(huán)，解釋了谷胱甘肽在氨基酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)中的機(jī)制，見圖1-2。

④GSH參與卵母細(xì)胞受精和早期胚胎發(fā)育過(guò)程。在許多哺乳動(dòng)物中，卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中合成GSH，在小鼠（Calvin等，1986）、倉(cāng)鼠、豬（Yoshida等，1992）、牛（de Matos等，1996；de Matos and Furnus，2000）和羊（de Matos等，2002）.中都有報(bào)道。卵母細(xì)胞在卵巢內(nèi)發(fā)育成熟過(guò)程中，卵母細(xì)胞內(nèi)GSH的濃度會(huì)隨著排卵的臨近而持續(xù)升高，卵母細(xì)胞成熟期間GSH的積累將會(huì)改善卵母細(xì)胞的胞質(zhì)成熟質(zhì)量、保護(hù)卵母細(xì)胞在受精后的胚胎發(fā)育階段免于受到氧化損傷（de Matos等，2000）。卵母細(xì)胞受精后，GSH濃度顯著下降，這表明GSH參與了卵母細(xì)胞的受精過(guò)程，主要是參與受精后雄原核形成過(guò)程（de Matos等，2002）。已經(jīng)有報(bào)道指出，向豬、牛卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液中添加能夠促進(jìn)GSH合成的物質(zhì)將會(huì)提高卵母細(xì)胞發(fā)育到囊胚的能力（De Matos and Furnus，2000）。卵母細(xì)胞在含有新生牛血清（newborn calf seum，NBCS）、PVA（polyvinyl alcohol，PVA）、半胱氨酸和表皮生長(zhǎng)因子的成熟液中成熟后，卵母細(xì)胞的成熟率高于僅僅添加PVA組卵母細(xì)胞的成熟率。在豬卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)液中增加半胱氨酸和表皮生長(zhǎng)因子可以提高卵母細(xì)胞的成熟率及顯微受精（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）胚的卵裂率，這可能也是由于增加GSH的濃度的緣故。研究表明，在生理?xiàng)l件下，成熟的小鼠和倉(cāng)鼠卵母細(xì)胞中高的GSH濃度是受精后形成雄性原核和促進(jìn)早期胚胎發(fā)育的基礎(chǔ)。GSH水平標(biāo)志著哺乳動(dòng)物胚胎質(zhì)量和發(fā)育能力。成熟MⅡ（metap haseⅡ stage，MⅡ）期卵母細(xì)胞中GSH的含量最高。一般來(lái)說(shuō)，MⅡ卵母細(xì)胞中GSH濃度是生發(fā)泡破裂時(shí)卵母細(xì)胞的2倍。如用人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadot ropin，HCG）誘導(dǎo)倉(cāng)鼠排卵，卵母細(xì)胞中GSH濃度在隨卵母細(xì)胞的發(fā)育而增加，從GV階段的1.0pmol/Oocyte到MⅠ階段期的1.62pmol/Oocyte，最后增加到MⅡ階段的2.0pmol/oocyte。然而，在受精合子和胚胎發(fā)育的早期，GSH水平下降非常快。在倉(cāng)鼠胚胎植入前到囊胚階段，GSH的濃度還達(dá)不到MⅡ卵母細(xì)胞中GSH濃度的10%。已排卵的卵母細(xì)胞中相對(duì)高的GSH濃度可以作為胚胎發(fā)育到孵植前抗氧化的潛在儲(chǔ)庫(kù)。

半胱胺能夠提高半胱氨酸吸收，增加GSH合成所需的底物（Meister等，1983）。體外成熟培養(yǎng)液中添加半胱胺能改善雄原核的形成，在山羊（Rodriguez-Gonzalez等，2003）、水牛和豬上都有研究。缺乏半胱胺對(duì)雄原核形成有影響在豬和牛上也有報(bào)道。半胱胺增強(qiáng)精子去凝集在體外成熟的倉(cāng)鼠卵母細(xì)胞上都有報(bào)道。GSH能促進(jìn)雄原核形成物質(zhì)的形成。

（3）半胱胺和胱氨酸在促進(jìn)卵母細(xì)胞GSH合成作用　在卵母細(xì)胞中，低分子質(zhì)量的巰基化合物催化合成谷胱甘肽，這些巰基化合物的有效成分為含硫氨基酸，如半胱氨酸和胱氨酸、半胱胺或β-巰基乙醇。巰基化合物誘導(dǎo)GSH合成提高合子中GSH的濃度，促進(jìn)胚胎發(fā)育到囊胚階段。大量的證據(jù)證明，GSH是在γ-谷氨酸循環(huán)中合成，而且它的合成依賴于氨基酸前體（如半胱氨酸）的獲得。另一方面，胱氨酸可能是被卵丘細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榘腚装彼幔缓髤⑴cGSH的合成。此外，其他低分子巰基化合物（如半胱胺、β-巰基乙醇）能夠還原胱氨酸為半胱氨酸。

半胱胺作為重要的巰基物質(zhì)，目前關(guān)于它的研究主要集中在應(yīng)用其改善卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量方面。現(xiàn)在已經(jīng)證明牛、豬、水牛、山羊、綿羊和成鼠等在卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程中添加半胱胺能促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)GSH合成，幫助穿卵精子解聚和雄原核形成，進(jìn)而提高胚胎發(fā)育水平。TCM199中的半胱氨酸含量很低（0.6μM）且十分不穩(wěn)定，易被氧化成為胱氨酸（Sagara等，1993），這樣就可能會(huì)使GSH合成受阻。TCM199中胱氨酸的含量相對(duì)較高（83.2μmol/L），有實(shí)驗(yàn)證明像半胱胺和β-巰基乙醇這樣的低分子量的巰基物質(zhì)能夠通過(guò)還原胱氨酸為半胱氨酸，并通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞對(duì)半胱氨酸的利用來(lái)促進(jìn)GSH合成。

目前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GSH的合成取決于培養(yǎng)液中半胱氨酸的利用，半胱氨酸是唯一的氨基酸前體，在卵母細(xì)胞中通過(guò)丙氨酸、絲氨酸、半胱氨酸運(yùn)輸體系被吸收。然而，在細(xì)胞外環(huán)境中半胱氨酸非常不穩(wěn)定，易被氧化成胱氨酸，降低GSH的合成。牛體外成熟培養(yǎng)液中添加胱氨酸僅能促進(jìn)COCs GSH的合成，卵丘細(xì)胞在將胱氨酸轉(zhuǎn)化為半胱氨酸過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用。IVM培養(yǎng)液中同時(shí)添加半胱胺和胱氨酸，在沒有卵丘細(xì)胞存在的條件下也提高了卵母細(xì)胞中的GSH含量。低分子量的巰基化合物，例如半胱胺和β-巰基乙醇，添加到成熟培養(yǎng)液中能夠提高GSH水平，改善豬體外受精卵母細(xì)胞發(fā)育能力。

（三）研究的主要內(nèi)容

針對(duì)性成熟前動(dòng)物得到的卵母細(xì)胞發(fā)育能力差這個(gè)問(wèn)題，我們以不同周齡的小鼠為研究模型，進(jìn)行了以下幾個(gè)方面的研究，希望能找出性成熟前動(dòng)物卵母細(xì)胞發(fā)育能力差的原因，從而提高性成熟前動(dòng)物卵母細(xì)胞發(fā)育能力。

①卵泡直徑和卵母細(xì)胞直徑是衡量卵母細(xì)胞質(zhì)量的一個(gè)指標(biāo)，直徑大的卵泡卵母細(xì)胞發(fā)育能力顯著高于小直徑的卵泡卵母細(xì)胞，卵泡和卵母細(xì)胞發(fā)育同步化程度反映卵泡內(nèi)顆粒細(xì)胞的數(shù)量，這些問(wèn)題在性成熟前后卵泡、卵母細(xì)胞上是否有差別。

②多精受精是性成熟前動(dòng)物卵母細(xì)胞體外受精后普遍存在的問(wèn)題，多精受精導(dǎo)致胚胎發(fā)育異常或發(fā)育阻滯，所以我們需要深入研究多精受精產(chǎn)生的原因，降低多精受精比例，提高囊胚發(fā)育率。

③促性腺激素能增加大的有腔卵泡的數(shù)量，但是對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育能力的影響眾說(shuō)紛紜，我們以小鼠為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ屠^續(xù)深入研究促性腺激素對(duì)性成熟前動(dòng)物卵母細(xì)胞發(fā)育能力、多精受精情況的影響。

④谷胱甘肽是卵母細(xì)胞胞質(zhì)中存在能夠促進(jìn)雄原核形成的物質(zhì)，近年來(lái)被普遍認(rèn)為是卵母細(xì)胞胞質(zhì)成熟的指標(biāo)，成熟培養(yǎng)液中添加胱氨酸和半胱氨酸能夠促進(jìn)卵母細(xì)胞胞質(zhì)中谷胱甘肽的合成，從而改善卵母細(xì)胞發(fā)育能力，這在性成熟動(dòng)物中都已經(jīng)被證明，能否改善性成熟前動(dòng)物卵母細(xì)胞發(fā)育能力，以及改善的程度值得研究。

⑤對(duì)于卵母細(xì)胞胞質(zhì)中谷胱甘肽合成來(lái)說(shuō)，γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和GSH合成酶是最為關(guān)鍵的兩個(gè)酶，其中γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶包括催化亞基（GCLC）和調(diào)節(jié)亞基（GCLM），這些酶在性成熟前后小鼠卵母細(xì)胞中表達(dá)是否存在差別需要進(jìn)行研究。

⑥促性腺激素對(duì)卵母細(xì)胞胞質(zhì)中GSH的合成能力以及對(duì)GSH合成最為關(guān)鍵的兩個(gè)酶是否存在影響，需要我們進(jìn)行研究。

二、材料與方法

（一）主要試劑及配制

若無(wú)特殊說(shuō)明，實(shí)驗(yàn)所用試劑均購(gòu)自Sigma公司。試劑配制及分裝時(shí)所用的玻璃器皿都是采用170℃高溫干熱2h以上滅菌的；塑料平皿都是采用紫外燈照射40min以上滅菌的；其他塑料器皿都經(jīng)過(guò)120℃、1.5個(gè)大氣壓濕熱滅菌15～30min。

卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液：TCM-199（Gibco，Grand Island，New York，USA）添加10%（體積分?jǐn)?shù)）FCS（GIBCO）、24.2mg/L丙酮酸鈉、0.05IU/ml FSH、0.05IU/ml LH、1μg/ml 17β-雌二醇、10ng/ml EGF、100IU/ml的青霉素和0.05mg/ml硫酸鏈霉素。半胱胺和胱氨酸分別配制成20mmol/L和100mmol/L濃儲(chǔ)液，培養(yǎng)時(shí)根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要用成熟培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋使用。培養(yǎng)條件為：20～30枚卵母細(xì)胞/100μl成熟培養(yǎng)液，覆蓋石蠟油，37℃，5%CO₂，100%濕度。

M2操作液：每100ml七蒸水中加入NaCl 0.55319g、KCl 0.03563g、CaCl₂·2H₂O 0.02514g、KH₂PO₄ 0.016195g、MgSO₄ 0.0143276g、NaHCO₃ 0.035g、Hepes 0.496855g、乳酸鈉0.4349g、丙酮酸鈉0.00363g、葡萄糖0.1001912g、BSA 0.4g、青霉素0.006g、鏈霉素0.005g、酚紅鈉0.001g。

獲能及授精液：基礎(chǔ)液為T6液（Quinn等，1982），每100ml七蒸水中加入NaCl 0.666g、KCl 0.0238g、MgCl₂.6H₂O 0.01g、CaCl₂·2H₂O 0.0294g、NaH₂PO₄·2H₂O 0.016195g、NaHCO₃ 0.209g、葡萄糖0.1g、丙酮酸鈉0.0055g、乳酸鈉0.1121g、Hepes 0.24g、酚紅鈉0.001g。獲能液為T6+10mg/mlBSA，受精液為T6液+20mg/mlBSA。

SrCl₂激活液：先用七蒸水將SrCl₂配成100mmol/l濃儲(chǔ)液，保存于4℃，激活前用無(wú)Ca無(wú)糖CZB將其稀釋10倍。

胚胎培養(yǎng)液：無(wú)糖CZB液，即每100ml超純水中加入NaCl 0.476987g、KCl 0.036008g、KH₂PO₄ 0.01606g、MgSO₄ 0.0144207g、NaHCO₃ 0.211033g、CaCl₂·2H₂O 0.0250g、乳酸鈉0.350748g、丙酮酸鈉0.00297g、EDTA 0.004094g、谷氨酰胺0.01461g、BSA 0.5g、青霉素0.006g、硫酸鏈霉素0.005g。含糖CZB液，即在無(wú)糖CZB的基礎(chǔ)上每100ml添加0.1g葡萄糖。

（二）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及超排處理

本實(shí)驗(yàn)使用的小鼠均為昆明白品系，自繁自養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)所用雌鼠為成年鼠6～8周，幼鼠19～21d，雄鼠為8～12周齡。控光（黑暗20：00～次日6：00；光照6：00～20：00）超排處理：腹腔注射PMSG 10IU/只，46h后取GV期卵母細(xì)胞。

（三）卵母細(xì)胞的獲取及體外成熟

體外成熟卵母細(xì)胞的獲取：雌鼠腹腔注射10IU PMSG/只，46h后頸椎脫臼法殺鼠摘取卵巢。剔除卵巢周圍的脂肪組織和輸卵管，用M2清洗兩遍，洗去血液和脂滴。把卵巢置于M2操作液中，在實(shí)體顯微鏡下，用刺卵針挑破卵巢表面直徑大于320μm的有腔卵泡，收集卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體（COCs）。從收集的COCs中選取達(dá)到最大直徑（＞70μm）、卵丘完整而且致密、層數(shù)在三層以上、卵母細(xì)胞形狀規(guī)則、胞質(zhì)均勻無(wú)顆粒、胞質(zhì)顏色正常，呈均勻的淺黃色的GV期COCs，成熟培養(yǎng)液洗滌3遍后培養(yǎng)。

卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)：采用微滴培養(yǎng)體系，嚴(yán)格控制培養(yǎng)條件（每個(gè)培養(yǎng)液滴體積為100μl），表面覆蓋薄層石蠟油，預(yù)平衡2h后用于培養(yǎng)，每滴培養(yǎng)30枚左右卵母細(xì)胞。將洗滌后的卵母細(xì)胞移入已平衡好的培養(yǎng)液滴中，置于37.5℃、5%CO₂、95%空氣、飽和濕度的CO₂培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。從殺鼠至培養(yǎng)的全部操作限制在40min內(nèi)完成。

（四）卵母細(xì)胞體外受精

選取性成熟（10～12周齡）昆明白雄鼠，已通過(guò)交配實(shí)驗(yàn)證明其有受精能力，頸椎脫臼法處死，從附睪尾和輸精管收集精子，將收集的精子團(tuán)塊置入1ml含10mg/ml BSA的T6液滴內(nèi)，用口吸管輕輕吹打，使精子團(tuán)分散開，于37℃、5%CO₂及飽和濕度的CO₂培養(yǎng)箱內(nèi)中孵育1.5h左右，進(jìn)行獲能。在此期間用細(xì)胞計(jì)數(shù)板檢測(cè)精子密度。將hCG后12h或IVM14h的卵母細(xì)胞在受精液（T6+20mg/mlBSA）中洗3次，移入已經(jīng)平衡過(guò)夜的受精滴（20枚/40μl）中，加入適量體積的獲能精子，使精子密度在1×10⁶個(gè)/ml左右。培養(yǎng)6h后，用無(wú)糖CZB液洗去卵母細(xì)胞周圍附著精子，選取含兩原核和第二極體的受精卵，置于無(wú)糖CZB中培養(yǎng)。

（五）氯化鍶激活

體外成熟卵母細(xì)胞（COCs要提前脫卵丘）分別用M2液及含20mmol/L SrCl₂的無(wú)鈣無(wú)糖CZB液洗3遍，然后將卵母細(xì)胞置于含20mmol/L SrCl₂的無(wú)鈣無(wú)糖CZB液中培養(yǎng)2.5h，之后轉(zhuǎn)入不含SrCl₂的無(wú)糖CZB液中繼續(xù)培養(yǎng)3.5h，即在激活處理6h后觀察原核、統(tǒng)計(jì)激活率。

為了維持孤雌激活胚胎的二倍性，激活液和6h檢查原核前短期培養(yǎng)的培養(yǎng)液中均添加5μg/ml的CB。

（六）胚胎培養(yǎng)

將孤雌激活或體外受精后的卵母細(xì)胞移入不含CB的無(wú)糖CZB中繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)有2/3的胚胎到達(dá)4-細(xì)胞時(shí)，將胚胎換液于含5.5mmol/L葡萄糖的CZB中繼續(xù)培養(yǎng)至發(fā)育到囊胚。在激活或受精后的48h、72h、96h各觀察1次，記錄4-細(xì)胞、桑椹胚和囊胚的發(fā)育情況。

（七）多精受精觀察

體外受精8h取出受精卵，用孔徑與受精卵直徑接近的擼卵針將周圍的精子去掉，放在玻璃載玻片上制成標(biāo)本。標(biāo)本用醋酸酒精溶液（體積比1∶3）固定至少24h后，用1%醋酸地衣紅染色，相差顯微鏡下觀察多精受精情況，將兩原核兩極體（或只有第二極體）的視為正常受精，多于進(jìn)入卵母細(xì)胞的視為多精受精。原核直徑測(cè)量：體外受精8h后，將兩原核受精卵取出壓片，壓片時(shí)，蓋玻片四邊中點(diǎn)各放寬約20μm，厚度相同的塑料，使卵母細(xì)胞被壓扁的程度相同。標(biāo)本用醋酸酒精溶液（體積比1∶3）固定至少24h后，用1%醋酸地衣紅染色，在帶有目鏡測(cè)微尺的相差顯微鏡下測(cè)量雌雄原核直徑，結(jié)果為兩者平均值。

（八）發(fā)情周期觀察

整個(gè)發(fā)情周期都伴隨著血液中激素濃度的高低變化，陰道上皮細(xì)胞也隨之變化，所以借助陰道黏液鏡檢，根據(jù)其中所含陰道上皮細(xì)胞形態(tài)，可對(duì)其發(fā)情周期所處的階段進(jìn)行判斷。具體做法是暴露小鼠陰道，右手持滴管吸少量滅菌生理鹽水滴入陰道口，當(dāng)稍放松尾部及腰部時(shí)，生理鹽水即被吸入陰道，稍候三指輕壓腰部，黏液隨生理鹽水流出，吸入滴管中，滴到載玻片上涂片，片子自然干燥后用酒精（95%）固定5min，然后用1%伊紅染液染15min，水洗干燥后在光學(xué)顯微鏡下觀察。

根據(jù)陰道上皮細(xì)胞變化情況，將發(fā)情周期分為以下4個(gè)階段。

Ⅰ期（發(fā)情前期）：黏液中有上皮細(xì)胞，有核細(xì)胞居多。

Ⅱ期（發(fā)情期）：涂片中幾乎全是無(wú)核的或有核的角化上皮細(xì)胞，細(xì)胞大而扁平，邊緣不整齊。

Ⅲ期（發(fā)情末期）：少量較老的有核細(xì)胞呈散在，其間有許多白細(xì)胞。

Ⅳ期（間情期）：涂片中幾乎全是白細(xì)胞。

在整個(gè)過(guò)程中對(duì)小鼠的操作動(dòng)作小心輕柔，向陰道口滴與從陰道口回吸生理鹽水時(shí)吸管盡量不碰到陰唇。

（九）卵母細(xì)胞谷胱甘肽含量的測(cè)定

根據(jù)1994年Funahashi等采用的方法進(jìn)行卵母細(xì)胞谷胱甘肽含量檢測(cè)。將未成熟和不同條件下成熟的卵母細(xì)胞脫卵丘，M2洗3次后用無(wú)菌蒸餾水再洗2次。將洗滌后的卵母細(xì)胞（35～40個(gè)）移入含5μl蒸餾水和5μl 1.25mmol/L磷酸的1.5ml離心管中。若不立即檢測(cè)活性，可將樣品存于-70℃?zhèn)溆谩Ｈ袅⒓礄z測(cè)活性，可將樣品反復(fù)凍融3次，然后應(yīng)用DTNB-GSSG還原酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)GSH含量。向樣品離心管中加入700μl封閉緩沖液（含有0.33mg/ml NADPH，0.2mmol/L磷酸鈉，10mmol/L EDTA；調(diào)整緩沖液pH值為7.2），100μl含6mmol/L DTNB液，然后加入10μl 250IU/ml GSH還原酶，迅速混勻以起始反應(yīng)。用可見光分光光度計(jì)在412nm處檢測(cè)光吸收值，每30s中記錄1次數(shù)據(jù)，記錄3分鐘內(nèi)的幾次光吸收值。本實(shí)驗(yàn)中需同時(shí)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)GSH樣品（分別含0.01mmol/L、0.02mmol/L、0.1mmol/L、0.2mmol/L、1.0mmol/L GSH）和空白樣品（不含GSH）的光吸收值，以作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照。將每個(gè)樣品的GSH含量除以樣品所包含的卵母細(xì)胞數(shù)即為每個(gè)卵母細(xì)胞的GSH含量。

（十）皮質(zhì)顆粒染色

除特殊說(shuō)明外，所有的實(shí)驗(yàn)步驟均在室溫下進(jìn)行。將收集的體內(nèi)及體外成熟卵母細(xì)胞、受精卵和孤雌激活卵在含0.5%鏈霉蛋白酶（Roche）的M2液中于37℃消化3～5min，除去透明帶。卵母細(xì)胞在M2中洗3次后，用含3.7%多聚甲醛的PBS在室溫下至少固定30min；然后用封閉液（blocking solution含0.3% BSA和100mM甘氨酸的M2）洗3次，每次至少5min；用含0.1% TritonX-100的M2處理5min；用blocking solution清洗2次后，在避光條件下，卵母細(xì)胞在含100μg/ml異硫氰酸熒光素標(biāo)記的扁豆凝集素（FITC-LCA）的M2中至少孵育30min。然后用含0.3% BSA和0.01% TritonX-100的M2洗3次，每次5min，卵母細(xì)胞核用含10μg/ml碘化丙錠（PI）的M2孵育10min，以評(píng)價(jià)細(xì)胞核的階段和精子穿透。用M2充分清洗后，卵母細(xì)胞被放在玻璃載玻片上制成標(biāo)本，放到暗盒中待觀察。

（十一）激光掃描共聚焦顯微術(shù)

制備好的樣品，用裝有氪-氬離子激光管的Leica TCS SP Ⅱ型激光掃描共聚焦顯微鏡觀察并照相。Hoechst 33342的熒光用二極激光管的405nm波長(zhǎng)激發(fā)。FITC和PI的熒光用Ar/ArHr激光管的488nm波長(zhǎng)激發(fā)，發(fā)射光通過(guò)一個(gè)488nm的濾片。單個(gè)的視覺截面是假顏色，用Leica共聚焦軟件組合成一個(gè)復(fù)合的圖片。

（十二）卵泡直徑、卵母細(xì)胞直徑的測(cè)量

用扎卵針分離性成熟前后小鼠卵泡，在帶有目鏡測(cè)微尺的顯微鏡下測(cè)量，劃破卵泡，取出卵母細(xì)胞，測(cè)量卵母細(xì)胞的直徑，顯微鏡倍數(shù)為400倍。

（十三）定量PCR

1.藥品

藥品見表1-1。

2.儀器

儀器見表1-2。

3.主要數(shù)據(jù)庫(kù)

GenBank：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov.

4.試劑配制

5×TBE電泳緩沖液：750ml雙蒸水中溶解54g Tris · base、27.5g硼酸、4.65g EDTA。

50×TAE電泳緩沖液：750ml雙蒸水中溶解242g Tris堿，加入57.1ml冰乙酸、100ml 0.5M EDTA（pH8.0），用雙蒸水定容至1000ml。

0.1%DEPC處理水：1000ml雙蒸水加1ml DEPC，混勻，37 ℃過(guò)夜，高壓滅菌

5. RNA的提取

凡與RNA操作有關(guān)的玻璃器皿和剪刀、鑷子等器械經(jīng)常規(guī)洗滌烘干后，用錫箔紙包好，200℃烘烤2～4h。塑料制品用0.1% DEPC浸泡處理37℃ 2h，或室溫處理過(guò)夜，再用滅菌雙蒸水漂洗數(shù)次，高壓滅菌去除DEPC。

GV期卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合物，離心（2000～3000g/5～10min）棄上清，加入適量trizol，劇烈振蕩15s至液體澄清，-70℃保存，trizol終體積500μl。

①向trizol離心管中加100μl氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置2～3min。

②4℃ 12000g離心15min，見分層。

③用黃槍頭吸取上層水相，約200μl，置另一離心管中（不要吸到中間層的有機(jī)相）。

④向離心管中加入等體積的異丙醇，混勻，室溫放置10min，現(xiàn)RNA沉淀。

⑤DEPC·H₂O配75%乙醇。

⑥離心完后棄上清，加500μl 75%乙醇，用指輕彈管壁使RNA沉淀飄起。

⑦4℃ 7500g離心15min，沉淀即總RNA，棄乙醇，用離心機(jī)再甩一下離心管，用黃槍頭將乙醇吹出，打開管蓋，稍涼。

⑧加入10μl DEPC·H₂O，輕彈幾下讓RNA溶解。

⑨分裝后-80℃保存。

6. RNA濃度和質(zhì)量檢測(cè)

分別采用1.5%普通瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計(jì)法檢測(cè)定RNA的抽提質(zhì)量和濃度。根據(jù)測(cè)定濃度將各RNA樣品稀釋為1μg/μl。電泳檢測(cè)RNA提取質(zhì)量，所提取RNA A₂₆₀/A₂₈₀在1.8～2.0之間時(shí)，用作RT-PCR分析。

7. cDNA的合成

cDNA合成參照Invitrogen公司的SuperScriptⅢ^TM Reverse Transcriptase說(shuō)明書進(jìn)行。采取20μl體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，具體操作如下。

①在DEPC處理過(guò)的0.2mL反應(yīng)管中加入相關(guān)混合液（表1-3）。

②PCR儀中65℃保溫5min，迅速取出置于冰上急冷2min以上，這樣可以減弱二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，提高反轉(zhuǎn)錄效率。

③高速離心數(shù)秒使模板RNA、引物等混合液聚集于管底。

④配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液（表1-4）。

⑤PCR儀中50℃保溫1h，然后70℃保溫15min后冰上冷卻，-20℃保存待用。

8. QPCR反應(yīng)

（1）定量PCR所用引物設(shè)計(jì)及合成　根據(jù)GeneBank中已公布的小鼠Gclc、Gclm、Gss、Gapdh基因序列，根據(jù)跨內(nèi)含子的引物設(shè)計(jì)原則，分別利用DNAMAN、OLIGO6.0、Prime5.0軟件設(shè)計(jì)各基因引物，交由上海生物工程公司合成。將合成的引物用DEPC處理的五蒸水配制成100μmol/L的原液，-20℃保存，使用時(shí)稀釋為10μmol/L的工作液。定量PCR所用引物見表1-5。

（2）實(shí)時(shí)熒光定量PCR

①熒光定量PCR反應(yīng)體系。實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用SYBR Green I染料法，采用Stratagene公司的BrilliantⅡSYBR Green QPCR Mastr Mix試劑盒方法進(jìn)行。反應(yīng)在Stratagene MX3000P熒光定量PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)體系10μl，體系成分見表1-6。

②定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線、擴(kuò)增曲線、溶解曲線的獲得。對(duì)用于定量的每個(gè)模板取等量cDNA混勻到一個(gè)PCR管內(nèi)，依次進(jìn)行5×梯度稀釋，制作5～7個(gè)濃度梯度（即原始濃度、5×、25×、125×、625×，依此類推）。目的基因和持家基因均按照上述PCR步驟進(jìn)行擴(kuò)增，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)斜率（k）計(jì)算出擴(kuò)增效率，計(jì)算公式為擴(kuò)增效率e=10^1/（-k）-1。當(dāng)目的基因的擴(kuò)增效率和持家基因的擴(kuò)增效率相近（即二者的斜率相差不超過(guò)0.2）時(shí)，可以使用“平均相對(duì)含量=2^-△△ct”法來(lái)計(jì)算該基因的相對(duì)表達(dá)量。具體計(jì)算方法參照Livak and Schmitten（2001）的方法。

標(biāo)準(zhǔn)曲線符合條件后，選擇合適的稀釋倍數(shù)，對(duì)每一個(gè)cDNA樣品分別進(jìn)行目的基因和持家基因的擴(kuò)增，單個(gè)樣品均做3次重復(fù)，得到ct值，選擇ct值變異系數(shù)小于1.5%的用于計(jì)算每個(gè)樣品的平均ct值。

溶解曲線和擴(kuò)增曲線程序自動(dòng)給出，溶解曲線呈單峰為特異性擴(kuò)增。

③基因mRNA相對(duì)表達(dá)量計(jì)算方法。本實(shí)驗(yàn)采用SYBR Green熒光染料法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增的檢測(cè)。SYBR Green實(shí)時(shí)定量PCR是通過(guò)對(duì)PCR擴(kuò)增過(guò)程中熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR每一循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化。熔解曲線鑒定PCR產(chǎn)物的特異性，如果在引物設(shè)計(jì)后預(yù)期產(chǎn)物T_m值處出現(xiàn)單一的曲線峰表示PCR產(chǎn)物是特異性的，而非特異性產(chǎn)物形成多個(gè)分離的曲線峰。ct值是反應(yīng)體系內(nèi)熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，通過(guò)測(cè)定ct值可反映出基因起始模板濃度，ct值越小則模板濃度越大，反之越小。以管家基因（GAPDH）作為內(nèi)標(biāo)基因，通過(guò)對(duì)待測(cè)基因以及內(nèi)標(biāo)基因的均一化處理可測(cè)定出待測(cè)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的相對(duì)量。因?yàn)楣芗一虮磉_(dá)量相對(duì)穩(wěn)定，受外界因素影響后表達(dá)變化小。

（十四）實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)及數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)反正弦轉(zhuǎn)換后符合正態(tài)分布，在One-Way ANOVA Options中通過(guò)Descriptive統(tǒng)計(jì)學(xué)分析獲得平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)誤，在One-Way Analysis of Variance中通過(guò)LSD多重比較進(jìn)行試驗(yàn)組間差異性分析。P＜0.05為差異顯著。

三、結(jié)果與分析

（一）性成熟及促性腺激素對(duì)小鼠卵母細(xì)胞體外發(fā)育能力的影響

本實(shí)驗(yàn)我們研究了不同周齡小鼠卵母細(xì)胞經(jīng)體外成熟、受精后的發(fā)育能力，以及注射PMSG對(duì)性成熟前后小鼠卵母細(xì)胞發(fā)育能力的影響。小鼠卵母細(xì)胞，體外成熟14h，受精后，記錄2-細(xì)胞、4-細(xì)胞和囊胚比例。結(jié)果見表1-7。

結(jié)果表明，幼鼠卵母細(xì)胞經(jīng)體外受精后卵裂率、囊胚發(fā)育率都顯著低于成年鼠（8.8% Vs 38%），4周小鼠卵母細(xì)胞囊胚發(fā)育率接近成年鼠水平（30% Vs 38%），注射PMSG能顯著提高性成熟前后小鼠卵母細(xì)胞發(fā)育能力，幼鼠由8.8%提高到51.1%，成年鼠由38%提高到57.5%，幼鼠卵母細(xì)胞發(fā)育能力達(dá)到了成年鼠水平。

（二）性成熟及促性腺激素對(duì)小鼠卵母細(xì)胞體外受精后多精受精情況及正常受精受精卵原核直徑的影響

本實(shí)驗(yàn)研究性成熟和促性腺激素對(duì)小鼠卵母細(xì)胞體外受精后，多精受精及兩原核受精卵原核直徑的影響。卵母細(xì)胞體外受精8h后，用孔徑接近卵母細(xì)胞直徑的擼卵針將卵母細(xì)胞周圍的精子去掉，在載玻片上制成標(biāo)本，醋酸酒精溶液（體積比1∶3）固定至少24h，用1%地衣紅染色，相差顯微鏡下觀察正常受精和多精受精及正常受精的受精卵的原核直徑，正常受精為兩原核加一個(gè)或兩個(gè)極體，多精受精為多于一個(gè)精子進(jìn)入卵母細(xì)胞，精子穿透率為正常受精和多精受精總和。原核直徑測(cè)量：壓片時(shí)，蓋玻片四邊中點(diǎn)各放寬約20μm、厚度相同的塑料，使卵母細(xì)胞被壓扁的程度相同，在帶有目鏡測(cè)微尺的相差顯微鏡下測(cè)量，結(jié)果為雌雄原核直徑平均值。

結(jié)果證明，性成熟前后小鼠卵母細(xì)胞經(jīng)體外受精后，精子穿透率沒有差別，注射PMSG能顯著提高精子穿透率（幼鼠80.9% Vs 95.5%，成鼠86.0% Vs 95.1%）；幼鼠卵母細(xì)胞多精受精比例顯著高于成鼠（54.3% Vs 37.7%），且幼鼠多精受精沒有形成原核的比例顯著高于成年鼠（74.9% Vs 38.3%），兩原核受精卵原核直徑在成鼠和幼鼠之間沒有顯著差異；PMSG處理顯著提高了性成熟前后小鼠卵母細(xì)胞兩原核受精卵的比例（幼鼠27.1% Vs 69.9%，成鼠48.9% Vs 74.5%），降低了多精受精（幼鼠54.3% Vs 26.2%，成鼠37.7% Vs 20.6%）和受精后未形成原核（幼鼠74.9% Vs 16.2%，成鼠38.3% Vs 11.3%）的比例，原核直徑也有顯著提高，幼鼠原核直徑由27.78μm顯著提高到41.67μm，成年鼠原核直徑?jīng)]有顯著提高，注射PMSG前后分別為34.25μm、40.42μm，幼鼠受精卵原核直徑達(dá)到了成鼠水平。表1-8為性成熟前后小鼠卵母細(xì)胞體外受精后受精情況及兩原核受精卵原核直徑的比較。

（三）性成熟及促性腺激素對(duì)小鼠卵母細(xì)胞體外受精后正常受精卵（兩原核受精卵）發(fā)育能力的影響

本實(shí)驗(yàn)研究性成熟及促性腺激素對(duì)小鼠卵母細(xì)胞體外受精后正常受精卵（兩原核受精卵）發(fā)育能力的影響卵母細(xì)胞經(jīng)體外成熟、受精后選取兩原核受精卵體外培養(yǎng)，記錄受精率及囊胚發(fā)育率。

結(jié)果表明（表1-9），性成熟前小鼠卵母細(xì)胞經(jīng)體外受精后正常受精比例顯著低于成年鼠（30.6% Vs 46.0%），注射PMSG后顯著提高了正常受精的比例（幼鼠30.6% Vs 79.7%，成鼠46.0% Vs 76.7%），幼鼠正常受精比例達(dá)到成年鼠水平；兩原核受精卵體外培養(yǎng)后，幼鼠囊胚發(fā)育率顯著低于成年鼠（幼鼠14.8% Vs 44.5%，成鼠35.6% Vs 45.9%），注射PMSG后顯著提高了性成熟前后卵母細(xì)胞的囊胚發(fā)育率，幼鼠由14.8%提高到44.5%，成鼠由35.6%提高到45.9%，且幼鼠達(dá)到成鼠水平。

（四）發(fā)情周期對(duì)成年鼠卵母細(xì)胞發(fā)育能力的影響

考慮到發(fā)情周期對(duì)成年鼠卵母細(xì)胞發(fā)育能力的影響，我們選擇前期和間期小鼠卵母細(xì)胞進(jìn)行體外成熟、受精以及受精卵的體外培養(yǎng)，觀察發(fā)情周期對(duì)成年鼠卵母細(xì)胞發(fā)育能力是否有影響。

結(jié)果表明，前期和間期小鼠卵母細(xì)胞經(jīng)體外成熟、受精后，卵母細(xì)胞受精率及囊胚發(fā)育率都沒有差別，前期和間期小鼠受精率分別為39.4%和45.9%，囊胚發(fā)育率分別為27.8%和30.8%，結(jié)論是成年鼠的發(fā)情周期對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育能力沒有影響。

（五）性成熟及促性腺激素對(duì)小鼠卵母細(xì)胞體外成熟后皮質(zhì)顆粒分布的影響

不同周齡小鼠卵母細(xì)胞體外成熟14h后，按材料方法進(jìn)行CGs染色和激光共聚焦顯微鏡觀察。根據(jù)2005年Liu等對(duì)卵母細(xì)胞皮質(zhì)顆粒分布階段的描述，MⅡ期卵母細(xì)胞的皮質(zhì)顆粒應(yīng)該沿質(zhì)膜下呈線狀排列，在紡錘體的上方出現(xiàn)無(wú)皮質(zhì)顆粒區(qū)，卵母細(xì)胞成熟后皮質(zhì)顆粒遷移不完全或提前發(fā)生胞吐都會(huì)導(dǎo)致多精受精。

結(jié)果表明，體外成熟后3周和4周小鼠卵母細(xì)胞皮質(zhì)顆粒遷移不完全比例沒有顯著差別（71.1% Vs 63.9%），4周和6～8周皮質(zhì)顆粒遷移不完全比例沒有顯著差別（63.9% Vs 58.7%），6～8周皮質(zhì)顆粒遷移不完全比例顯著低于3周小鼠，比例分別為71.1%和58.7%；注射PMSG后顯著提高了皮質(zhì)顆粒遷移完全的比例，3周小鼠皮質(zhì)顆粒遷移完全的比例從21.9%提高到70.1%，6～8周小鼠皮質(zhì)顆粒遷移完全的比例從36.7%提高到73.4%，3周和6～8周小鼠卵母細(xì)胞皮質(zhì)顆粒遷移完全的比例沒有顯著差別，提前胞吐的比例在性成熟前后及注射PMSG前后都沒有差別。（表1-11）

（六）性成熟及促性腺激素對(duì)小鼠卵母細(xì)胞胞質(zhì)中GSH含量的影響

本實(shí)驗(yàn)研究不同周齡小鼠卵母細(xì)胞體外成熟后，卵母細(xì)胞胞質(zhì)中GSH含量，及注射PMSG后對(duì)GSH含量的影響。體外成熟14h的MⅡ卵母細(xì)胞，按材料方法檢測(cè)GSH含量。結(jié)果表明，體外成熟后，3周小鼠卵母細(xì)胞胞質(zhì)中GSH含量顯著低于4周和6～8周，分別為1.68pmol/Oocyte、2.28pmol/Oocyte和2.46pmol/Oocyte，4周和6～8周GSH含量沒有差別，注射PMSG能顯著提高性成熟前后小鼠卵母細(xì)胞胞質(zhì)中GSH含量。幼鼠卵母細(xì)胞GSH含量達(dá)到了成年鼠水平（2.94pmol/Oocyte Vs 2.96pmol/Oocyte）（表1-12）。

（七）添加胱氨酸和半胱胺對(duì)性成熟前后小鼠卵母細(xì)胞及促性腺激素處理的小鼠卵母細(xì)胞發(fā)育能力的影響

本實(shí)驗(yàn)中，我們研究了向成熟培養(yǎng)液TCM-199中添加胱氨酸和半胱胺對(duì)性成熟前后自然周期小鼠卵母細(xì)胞及促性腺激素處理的小鼠卵母細(xì)胞發(fā)育能力的影響。結(jié)果如下（表1-13）。

①添加胱氨酸（100μmol/L）和半胱胺（200μmol/L）能顯著提高性成熟前后小鼠卵母細(xì)胞胚胎發(fā)育能力，幼鼠囊胚發(fā)育率由15.5%提高到24.0%，成鼠由30.1%提高到38.7%，幼鼠卵母細(xì)胞囊胚發(fā)育率還是低于成年鼠。

②將胱氨酸和半胱胺濃度提高1倍后（200μmol/L、400μmol/L），性成熟前后卵母細(xì)胞發(fā)育能力沒有繼續(xù)得到提高，幼鼠囊胚率24.0% Vs 27.8%，成鼠為38.7% Vs 38.2%，幼鼠卵母細(xì)胞發(fā)育能力顯著低于成年鼠。

③添加胱氨酸（200μmol/L）和半胱胺（400μmol/L）能顯著提高處理PMSG的性成熟前后小鼠卵母細(xì)胞發(fā)育能力，囊胚發(fā)育率幼鼠從40.9%提高到51.7%，成鼠從43.8%提高到60.2%。

（八）添加胱氨酸和半胱胺對(duì)性成熟前后小鼠卵母細(xì)胞胞質(zhì)中GSH含量的影響

由表1-13我們得出，添加胱氨酸（100μmol/L）和半胱胺（200μmol/L）能顯著提高性成熟前后小鼠卵母細(xì)胞胚胎發(fā)育能力，將濃度增加1倍后（200μmol/L、400μmol/L），性成熟前后卵母細(xì)胞發(fā)育能力沒有繼續(xù)得到提高，卵母細(xì)胞發(fā)育能力的提高是否與卵母細(xì)胞胞質(zhì)中GSH含量的變化有關(guān)？我們檢測(cè)了添加胱氨酸和半胱胺后，性成熟前后小鼠MⅡ期卵母細(xì)胞胞質(zhì)中GSH水平。結(jié)果表明（表1-14），幼鼠添加胱氨酸（100μmol/L）和半胱胺（200μmol/L）后，卵母細(xì)胞胞質(zhì)中GSH含量顯著增加，添加胱氨酸（200μmol/L）和半胱胺（400μmol/L）后，GSH水平?jīng)]有繼續(xù)得到顯著增加；成年鼠添加胱氨酸（100μmol/L）和半胱胺（200μmol/L）后，卵母細(xì)胞胞質(zhì)中GSH含量沒有顯著提高，添加胱氨酸（200μmol/L）和半胱胺（400μmol/L）后，GSH含量顯著增加，添加胱氨酸（100μmol/L）和半胱胺（200μmol/L）及胱氨酸（200μmol/L）和半胱胺（400μmol/L）的卵母細(xì)胞胞質(zhì)中GSH水平?jīng)]有顯著差異；添加胱氨酸和半胱胺前后，性成熟前小鼠卵母細(xì)胞胞質(zhì)中GSH水平都顯著低于成年鼠；注射PMSG的小鼠，添加胱氨酸（200μmol/L）和半胱胺（400μmol/L）后，性成熟前后小鼠卵母細(xì)胞胞質(zhì)中GSH水平都顯著提高。

（九）性成熟和促性腺激素對(duì)性成熟前后小鼠卵母細(xì)胞谷胱甘肽合成途徑酶表達(dá)的影響

GSH合成途徑有兩種酶，γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（GCL）和GSH合成酶（GSS），其中γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶有催化亞基（GCLC）和調(diào)節(jié)亞基（GCLM）組成，分別由不同的mRNA編碼，催化亞基催化半胱氨酸和谷氨酸結(jié)合形成γ-谷氨酰半胱氨酸，調(diào)節(jié)亞基沒有催化活性，但能與催化亞基結(jié)合，調(diào)節(jié)催化亞基的催化效率，調(diào)節(jié)反應(yīng)速度。本實(shí)驗(yàn)取性成熟前后小鼠GV期卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合物，檢測(cè)GSH合成途徑中的酶表達(dá)。

總RNA的提取與檢測(cè)：經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，RNA的完整性和純度均符合反轉(zhuǎn)錄的要求，結(jié)果如圖1-3所示，清晰可見5S、18S、28S三條條帶。經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定，所提取的總RNA在260nm的紫外吸收值與280nm的紫外吸收值比值均在1.8～2.0間，說(shuō)明無(wú)蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)污染。因此，提取的總RNA質(zhì)量完好，可用于進(jìn)一步RT-PCR和定量PCR。

定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線、溶解曲線、擴(kuò)增曲線的獲得：試驗(yàn)采用相對(duì)定量比較ct值法檢測(cè)mRNA的含量，圖1-4是持家基因GAPDH標(biāo)準(zhǔn)曲線制作圖，可以看出倍比稀釋的各點(diǎn)成一直線，擴(kuò)增效率99%，擴(kuò)增曲線（圖1-5）顯示擴(kuò)增產(chǎn)物呈S形曲線，檢測(cè)到熒光信號(hào)峰值較高，熔解曲線（圖1-6）為銳利的單峰，沒有雜峰，說(shuō)明檢測(cè)的ct值可靠。

1.GSH合成酶（GSS）mRNA表達(dá)

以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，使用特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖電泳檢測(cè)。電泳結(jié)果顯示目的基因cDNA的擴(kuò)增能獲得特異性產(chǎn)物，其擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為122bp，GAPDH擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為244bp。結(jié)果表明，性成熟前后小鼠卵母細(xì)胞GSS mRNA表達(dá)沒有差異（1 Vs 2.11，T檢驗(yàn)），注射PMSG后顯著提高了性成熟前后小鼠卵母細(xì)胞GSS mRNA表達(dá)，幼鼠由1提高到19.59，成鼠由2.11提高到36.2，成鼠和幼鼠之間沒有差異（T檢驗(yàn)）（圖1-7、圖1-8）。

2.谷胱甘肽還原酶（GSS）mRNA表達(dá)

以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，使用特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖電泳檢測(cè)。電泳結(jié)果顯示目的基因cDNA的擴(kuò)增能獲得特異性產(chǎn)物，其擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為135bp。結(jié)果表明，經(jīng)T檢驗(yàn)后，性成熟前后小鼠卵母細(xì)胞GCLC mRNA表達(dá)差異顯著（1Vs 2.28，T檢驗(yàn)），注射PMSG后顯著提高了性成熟前后小鼠卵母細(xì)胞GCLC mRNA表達(dá)，幼鼠由1提高到8.69，成鼠由2.28提高到11.04，成鼠和幼鼠之間沒有差異（T檢驗(yàn)）（圖1-9、圖1-10）。

3. γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶調(diào)節(jié)亞基（GCLM）mRNA表達(dá)

以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，使用特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖電泳檢測(cè)。電泳結(jié)果顯示目的基因cDNA的擴(kuò)增能獲得特異性產(chǎn)物，其擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為284bp。結(jié)果表明，經(jīng)T檢驗(yàn)后，性成熟前后小鼠卵母細(xì)胞GCLC mRNA表達(dá)差異顯著（1Vs 4.55，T檢驗(yàn)），注射PMSG后顯著提高了性成熟前后小鼠卵母細(xì)胞GCLC mRNA表達(dá)，幼鼠由1提高到24.16，成鼠由4.55提高到12.2，成鼠和幼鼠之間沒有差異（T檢驗(yàn)）（圖1-11、圖1-12）。

（十）體外成熟小鼠卵母細(xì)胞最佳SrCl₂激活濃度的研究

為了使體外培養(yǎng)的小鼠卵母細(xì)胞獲得較高的孤雌激活率及囊胚發(fā)育率，本研究對(duì)孤雌激活最佳SrCl₂濃度進(jìn)行了篩選。選擇注射PMSG的成年鼠體外成熟24h的卵母細(xì)胞，結(jié)果表明，30mmol/L SrCl₂濃度激活率最低78.1%，囊胚發(fā)育率為0，都顯著低于其他濃度；20mmol/L SrCl₂濃度得到的激活率和囊胚發(fā)育率最高（97.7% Vs 25.9%）（表1-15）。

（十一）性成熟和促性腺激素對(duì)小鼠卵母細(xì)胞孤雌激活后胚胎發(fā)育能力的影響

體外成熟24h的性成熟前后小鼠卵母細(xì)胞，用濃度20mmol/L的SrCl₂激活，然后進(jìn)行胚胎培養(yǎng)。結(jié)果表明（表1-16），3周、4周和6～8周小鼠卵母細(xì)胞，不管是COCs還是DO，成熟率和孤雌激活率都沒有差別；孤雌激活后的囊胚發(fā)育率不管是COCs還是DO，3周都顯著低于4周和6～8周，4周和6～8周囊胚發(fā)育率沒有顯著差別。COCs囊胚發(fā)育率分別為3周5.8%、4周11.1%、6～8周13.5%，DO囊胚發(fā)育率分別為3周0%、4周4.1%、6～8周5.6%，4周（27～28d）小鼠卵母細(xì)胞發(fā)育能力和成年鼠沒有差異，說(shuō)明已經(jīng)接近性成熟。

（十二）性成熟前后小鼠卵泡和卵母細(xì)胞發(fā)育同步化程度

卵泡和卵母細(xì)胞發(fā)育同步化程度，反映顆粒細(xì)胞增殖程度和卵母細(xì)胞生長(zhǎng)同步化程度以及能否用卵泡大小判斷卵母細(xì)胞發(fā)育能力（Lucas等，2003；Grazyna Ptak，2006）。我們選擇300μm以上的卵泡，測(cè)量卵母細(xì)胞直徑，結(jié)果表明，幼鼠和成年鼠卵泡和卵母細(xì)胞發(fā)育同步化程度相近（r=0.45Vs r=0.56），且性成熟前后小鼠卵母細(xì)胞直徑?jīng)]有差別（77.78±0.56μmVs 77.06±0.71μm），卵泡直徑也沒有差別（358.5±6.1μmVs 353.6±7.8μm）（圖1-13）。

四、討論

（一）性成熟和促性腺激素對(duì)小鼠卵母細(xì)胞體外發(fā)育能力的影響

卵母細(xì)胞發(fā)育能力是指卵母細(xì)胞經(jīng)成熟、受精或者孤雌激活后發(fā)育到胚胎特定時(shí)期的能力，本文主要研究發(fā)育到早期囊胚的能力。利用幼畜體外成熟卵母細(xì)胞能夠最大限度地縮短世代間隔，加速品種改良。雖然利用性成熟前動(dòng)物體外成熟、受精卵母細(xì)胞已經(jīng)成功地獲得了后代（Revel等，1995；O’Brien等，1997；Khatir等，1998a；Ptak等，1999），但是性成熟前動(dòng)物卵母細(xì)胞發(fā)育能力比成年動(dòng)物差，得到的胚胎移植后胎兒死亡的比例高，死亡原因不得而知（Seidel等，1971；Pinkert等，1989；Eppig等，1992；Revel等，1995；Damiani等，1996；Khatir等，1996；O’Brien等，1996；1997，Ledda等；1997，Izquierdo等，1999；Wu等，2007）。在小鼠上我們證明，核成熟率沒有差別這與以前報(bào)道小鼠和其他物種的結(jié)果相一致（Wu等，2007），不論是體外受精還是孤雌激活后的囊胚發(fā)育率幼鼠都顯著低于成年鼠，4周（27～29d）小鼠卵母細(xì)胞發(fā)育能力顯著高于3周小鼠，達(dá)到了成年鼠水平，3～4周齡卵母細(xì)胞發(fā)育能力迅速提高，這與Eppig and Schroeder（1987）發(fā)表的未處理促性腺激素的小鼠卵母細(xì)胞隨著年齡增長(zhǎng)（16～28d）、卵母細(xì)胞發(fā)育能力逐漸提高的結(jié)論一致。去除卵丘細(xì)胞對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育能力的影響，性成熟前后裸卵母細(xì)胞發(fā)育能力也存在差異。

激素處理能夠提高性成熟前卵母細(xì)胞發(fā)育能力在多種動(dòng)物上得到了證明，也有一些文章認(rèn)為激素處理對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育能力沒有作用或有副作用。促性腺激素能夠增加大的有腔卵泡的數(shù)量，引起卵泡顆粒細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)LHR的合成和類固醇生成酶的表達(dá)，調(diào)節(jié)卵泡內(nèi)的激素微環(huán)境。促性腺激素對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育能力的作用有兩種說(shuō)法，一種認(rèn)為促性腺激素作用于卵泡顆粒細(xì)胞，誘導(dǎo)信號(hào)，增加細(xì)胞內(nèi)cAMP水平（Loutradis等，1987，1994），通過(guò)縫隙連接傳遞給卵母細(xì)胞，cAMP是一種重要的信號(hào)分子，調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞成熟（Tsafriri等，1972），卵母細(xì)胞體外成熟由于脫離了卵泡內(nèi)的抑制環(huán)境，使細(xì)胞核成熟早于細(xì)胞質(zhì)成熟，核質(zhì)成熟不同步，增加細(xì)胞內(nèi)cAMP水平，能抑制卵母細(xì)胞核提前成熟，使細(xì)胞質(zhì)有足夠的時(shí)間完成成熟，改善卵母細(xì)胞發(fā)育能力。另一種認(rèn)為激素能夠直接作用于卵母細(xì)胞，因?yàn)樵趥}(cāng)鼠的卵母細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)了促性腺激素受體。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，性成熟前后小鼠注射PMSG后，COCs經(jīng)體外受精和孤雌激活后以及DO孤雌激活后，卵母細(xì)胞發(fā)育能力都得到了顯著改善，幼鼠卵母細(xì)胞發(fā)育能力達(dá)到了成年鼠水平。

（二）性成熟及促性腺激素對(duì)小鼠卵母細(xì)胞體外受精后多精受精情況及正常受精受精卵原核直徑的影響

性成熟前動(dòng)物卵母細(xì)胞體外受精后多精受精比例高于成年動(dòng)物在豬、山羊、綿羊等動(dòng)物都有證明（O’Brien等，1997）。多精進(jìn)入會(huì)引起胚胎染色體異常，從而導(dǎo)致胚胎死亡。多精受精發(fā)生的原因是卵母細(xì)胞胞質(zhì)成熟不完全，透明帶異常。卵母細(xì)胞胞質(zhì)中的皮質(zhì)顆粒參與阻止多精受精，卵母細(xì)胞成熟不夠會(huì)造成皮質(zhì)顆粒釋放障礙，引起多精受精，與成熟的卵母細(xì)胞相比，未成熟卵由于不能發(fā)生完善的皮質(zhì)反應(yīng)和透明帶反應(yīng)呈現(xiàn)較高的多精受精率。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明：性成熟前后小鼠卵母細(xì)胞經(jīng)體外受精后，精子入卵率沒有差別，注射PMSG能顯著提高精子入卵率；多精受精比例幼鼠顯著高于成鼠，且幼鼠多精受精沒有形成原核的比例顯著高于成年鼠，這在性成熟前山羊上也有相同的報(bào)道（A.Martino等，1994；Mogas等，1997）。

精子進(jìn)入卵母細(xì)胞后，卵母細(xì)胞中形成雄原核生長(zhǎng)因子（MPGF），MPGF可能是像核質(zhì)素（nucleoplasmin）一樣的物質(zhì)，是精核去致密所必需的。維持雌、雄原核形成所必需的物質(zhì)，其數(shù)量是有限的，當(dāng)精子進(jìn)入卵中之后，精核和卵核則競(jìng)相爭(zhēng)奪這種原核形成物質(zhì)。在小鼠和大鼠，精核比卵原核對(duì)原核形成物質(zhì)具有更大的親和力，因此，雄原核比雌原核大，但其他動(dòng)物則不是這樣。多精子進(jìn)入卵母細(xì)胞后，同時(shí)競(jìng)爭(zhēng)原核形成物質(zhì)，使原核直徑變小。原核直徑和卵母細(xì)胞發(fā)育能力具有相關(guān)性，可以用來(lái)判定體外受精后胚胎質(zhì)量及發(fā)育潛力。我們的結(jié)果表明：體外受精后兩原核受精卵原核直徑和成鼠相比雖然沒有顯著差異，但也略低于成鼠。PMSG處理顯著提高了性成熟前后小鼠卵母細(xì)胞正常受精的比例，原核直徑也有顯著的提高，幼鼠受精卵原核直徑達(dá)到了成年鼠水平。這些結(jié)果表明，多精受精是幼鼠卵母細(xì)胞發(fā)育能力差的一個(gè)因素。注射PMSG能夠降低多精受精的發(fā)生，可能與促性腺激素能夠延遲核成熟，使細(xì)胞質(zhì)成熟充分有關(guān)。

卵母細(xì)胞在成熟過(guò)程中，皮質(zhì)顆粒向皮質(zhì)遷移，完成核成熟、到達(dá)MⅡ期時(shí)，CGs沿質(zhì)膜下呈線狀排列，（Cran等，1989；譚景和，1995）。外排的皮質(zhì)顆粒內(nèi)容物中含有蛋白酶或糖苷酶，可溶解透明帶ZP₃（糖蛋白）而阻止多余精子與透明帶相結(jié)合，避免多精受精的發(fā)生（譚景和，《脊椎動(dòng)物比較胚胎學(xué)》）。皮質(zhì)顆粒遷移不完全或提前發(fā)生胞吐，都會(huì)引起多精受精的發(fā)生。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：卵母細(xì)胞成熟后，幼鼠皮質(zhì)顆粒遷移不完全比例顯著高于成年鼠，這也是幼鼠卵母細(xì)胞體外受精后，多精受精比例高，發(fā)育能力低的原因。注射PMSG后，顯著提高了皮質(zhì)顆粒遷移完全的比例，幼鼠和成鼠沒有差別，皮質(zhì)顆粒提前胞吐的比例，在性成熟前后和PMSG處理前后都沒有差別。

（三）性成熟及促性腺激素對(duì)小鼠卵母細(xì)胞胞質(zhì)中GSH含量的影響

在觀察多精受精時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，幼鼠卵母細(xì)胞經(jīng)體外受精后，精子去凝集形成原核的比例顯著低于成年鼠，注射PMSG后顯著提高了原核形成的比例。說(shuō)明多個(gè)精子進(jìn)入同時(shí)競(jìng)爭(zhēng)雄原核形成物質(zhì)，導(dǎo)致精核不能去凝集。精子細(xì)胞核的解聚需要精子細(xì)胞核中二硫鍵的還原來(lái)誘導(dǎo)。GSH提供啟動(dòng)雄原核形成之前染色質(zhì)解凝聚所需的還原基團(tuán)，另外，GSH還有抗氧化，維持減數(shù)分裂紡錘體形態(tài)，細(xì)胞膜穩(wěn)定等作用。因此我們測(cè)定了性成熟前后小鼠卵母細(xì)胞內(nèi)的GSH水平。結(jié)果表明，體外成熟后，幼鼠卵母細(xì)胞胞質(zhì)中的GSH含量顯著低于成年鼠，注射PMSG后顯著提高了胞質(zhì)中GSH的含量，幼鼠GSH含量達(dá)到成年鼠水平。這與Ulrike Luderer（2001）報(bào)道的注射PMSG后提高了大鼠卵巢中GSH含量的結(jié)果相一致。

谷胱甘肽的合成需要兩種酶三種底物，兩種酶分別是γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶，三種底物是胱氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺。細(xì)胞培養(yǎng)液中半胱氨酸迅速氧化成胱氨酸。進(jìn)入細(xì)胞后，迅速被還原為半胱氨酸（Bannai and Tateishi，1986）。TCM199中的半胱氨酸含量很低（0.6μmol/L）且十分不穩(wěn)定，易被氧化成為胱氨酸，這樣就可能會(huì)使GSH合成受阻。TCM199中胱氨酸的含量相對(duì)較高（83.2μmol/L），有實(shí)驗(yàn)證明象半胱胺和β-巰基乙醇這樣的低分子量的巰基物質(zhì)能夠通過(guò)還原胱氨酸為半胱氨酸，并促進(jìn)細(xì)胞對(duì)半胱氨酸的利用來(lái)促進(jìn)GSH合成。半胱胺能增加半胱氨酸吸收，現(xiàn)在已經(jīng)證明牛（de Matos等，1995）、豬、水牛、山羊、綿羊（de Matos等，2002）和小鼠（de Matos等，2003）等在卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程中添加半胱胺能促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)GSH合成，幫助入卵精子解聚和雄原核形成，進(jìn)而提高胚胎發(fā)育水平。

我們向成熟培養(yǎng)液中添加半胱胺和胱氨酸（100μmol/L、200μmol/L）能顯著提高性成熟前后卵母細(xì)胞的發(fā)育能力，這與本實(shí)驗(yàn)室之前報(bào)道的提高成年鼠卵母細(xì)胞發(fā)育能力的結(jié)論相一致。但性成熟前后小鼠卵母細(xì)胞發(fā)育能力還有差別，幼鼠卵母細(xì)胞發(fā)育能力還是比成鼠差。于是我們將濃度增加1倍，濃度分別為半胱胺200μmol/L和胱氨酸400μmol/L，這時(shí)卵母細(xì)胞發(fā)育能力沒有繼續(xù)得到改善，性成熟前后卵母細(xì)胞發(fā)育能力還是存在差別，我們檢測(cè)了半胱胺和胱氨酸濃度分別為200μmol/L、400μmol/L時(shí)，卵母細(xì)胞胞質(zhì)中的GSH含量，發(fā)現(xiàn)幼鼠顯著低于成鼠（0.64μmol/L±2.3μmol/L和2.10μmol/L±0.3μmol/L），說(shuō)明在底物充足的情況下，幼鼠卵母細(xì)胞合成GSH的能力顯著低于成年鼠。這一結(jié)果與2003年Matos報(bào)道的結(jié)果相一致（Matos等，2003）。于是我們檢測(cè)了GSH合成途徑中酶的mRNA表達(dá)，γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶包括催化亞基（GCLC）和調(diào)節(jié)亞基（GCLM），是谷胱甘肽合成途徑中的限速酶，分別由不同的mRNA編碼，催化亞基催化半胱氨酸和谷氨酸結(jié)合形成γ-谷氨酰半胱氨酸，調(diào)節(jié)亞基沒有催化活性，但能與催化亞基結(jié)合，調(diào)節(jié)催化亞基的催化效率，調(diào)節(jié)反應(yīng)速度。有報(bào)道表明，添加BSO（抑制GCL活性）能顯著降低谷胱甘肽的合成，增加了顆粒細(xì)胞凋亡和卵母細(xì)胞碎裂。在卵巢中健康卵泡Gclm表達(dá)水平高，而閉鎖卵泡GCLM表達(dá)量低，排卵前促性腺激素刺激使得膜細(xì)胞GCLM顯著增加，促性腺素處理后GCLC和GCLM水平增加，GCL酶活性增加，使得卵巢GSH合成顯著增加（Luderer U等，2001）。我們的結(jié)果表明，幼鼠卵母細(xì)胞中GCLC和GCLM mRNA水平顯著低于成鼠（T-test），谷胱甘肽合成酶表達(dá)兩者之間沒有差別，但也略低于成鼠。注射PMSG顯著提高了這三種酶的表達(dá)。

（四）性成熟前后小鼠卵泡和卵母細(xì)胞發(fā)育同步化程度

卵母細(xì)胞發(fā)育能力是隨著卵泡和卵母細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育逐漸獲得的。在這一過(guò)程中，卵母細(xì)胞存儲(chǔ)RNA和蛋白質(zhì)，細(xì)胞核發(fā)生GVBD，染色質(zhì)凝集，第一極體排出，以及M-Ⅱ抑制，卵胞質(zhì)發(fā)生細(xì)胞器重排，MAPK和MPF活性變化，Ca²⁺釋放機(jī)制等變化。卵泡直徑和卵母細(xì)胞直徑是衡量卵母細(xì)胞質(zhì)量的一個(gè)指標(biāo)，大卵泡獲得的卵母細(xì)胞發(fā)育能力顯著高于小卵泡，（Furher F，1989），卵母細(xì)胞直徑越大，發(fā)育能力越強(qiáng)。有報(bào)道表明，22天和26天小鼠卵母細(xì)胞發(fā)育能力有顯著差異，取相同大小的22天和26天小鼠卵母細(xì)胞體外受精后，26天小鼠卵母細(xì)胞發(fā)育能力顯著高于22天，這說(shuō)明卵母細(xì)胞獲得發(fā)育能力是與卵泡發(fā)育有關(guān)的。26天小鼠卵母細(xì)胞隨著直徑的增加發(fā)育能力增加（Eppig等，1992）。卵泡和卵母細(xì)胞發(fā)育同步化，反映顆粒細(xì)胞增殖程度和卵母細(xì)胞生長(zhǎng)同步化程度和能否用卵泡大小判斷卵母細(xì)胞發(fā)育能力。以前的報(bào)道表明豬和綿羊性成熟后卵泡細(xì)胞和卵母細(xì)胞發(fā)育才同步化，性成熟前羊卵母細(xì)胞和卵泡發(fā)育同步化沒有成年羊好（0.11 Vs 0.61）。我們?cè)谛∈笊系难芯勘砻鳎猿墒烨靶∈舐雅莺吐涯讣?xì)胞發(fā)育同步化程度與成鼠相差不多（0.45 Vs0.56）。而且，我們用于做發(fā)育實(shí)驗(yàn)的卵母細(xì)胞都是來(lái)自于大于300μm的卵泡，這部分卵泡所取得卵母細(xì)胞直徑在性成熟前后也沒有差別（性成熟前卵子直徑：77.78μm Vs 成年：77.06μm）。由此，我們得到結(jié)論，幼鼠卵母細(xì)胞發(fā)育能力差，不是因?yàn)橛资舐涯讣?xì)胞直徑小及卵丘細(xì)胞數(shù)量少導(dǎo)致的。

五、結(jié)論

①幼鼠卵母細(xì)胞發(fā)育能力比成年鼠差，去除卵丘細(xì)胞對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育能力的影響，裸卵卵母細(xì)胞發(fā)育能力在性成熟前后也有差別，4周小鼠卵母細(xì)胞發(fā)育能力接近于成年鼠水平，注射PMSG后顯著提高了性成熟前后卵母細(xì)胞發(fā)育能力，幼鼠卵母細(xì)胞發(fā)育能力達(dá)到了成年鼠水平。

②體外受精后，性成熟前后小鼠卵母細(xì)胞精子穿透率沒有差別，多精受精率幼鼠顯著高于成年鼠，而且幼鼠的多精受精沒有形成原核的比例顯著高于成年鼠。正常受精的受精卵，雌雄原核直徑平均值，性成熟前后卵母細(xì)胞沒有差別。促性腺激素能提高性成熟前后卵母細(xì)胞正常受精的比例，雄原核形成比例，以及正常受精受精卵的原核直徑。

③體外成熟后，幼鼠卵母細(xì)胞皮質(zhì)顆粒遷移不完全比例顯著高于成年鼠，4周小鼠與3周小鼠沒有差別，和6～8周小鼠也沒有差別。注射PMSG后，顯著提高了皮質(zhì)顆粒遷移完全的比例，3周和6～8周小鼠卵母細(xì)胞沒有顯著差異，提前胞吐的比例在性成熟前后及注射PMSG前后都沒有差別。

④體外成熟后，性成熟前后卵母細(xì)胞胞質(zhì)中GSH水平，幼鼠顯著低于成年鼠，注射PMSG后，顯著提高了性成熟前后卵母細(xì)胞GSH水平，幼鼠達(dá)到了成年鼠水平。

⑤成熟培養(yǎng)液中添加胱氨酸（100μmol/L）和半胱胺（200μmol/L）能提高性成熟前后卵母細(xì)胞發(fā)育能力，增加濃度（200μmol/L、400μmol/L）沒有繼續(xù)改善卵母細(xì)胞發(fā)育能力，向PMSG處理組卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng)液中添加胱氨酸（200μmol/L）、半胱胺（400μmol/L）顯著提高了卵母細(xì)胞發(fā)育能力，成鼠顯著高于幼鼠卵母細(xì)胞的囊胚發(fā)育率。

⑥GSH合成途徑中的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的兩個(gè)亞基，催化亞基（GCLC）和調(diào)節(jié)亞基（GCLM）在性成熟前后有顯著差別，谷胱甘肽合成酶表達(dá)兩者之間沒有差別，但也略低于成鼠。注射PMSG顯著提高了這三種酶的表達(dá)。

⑦卵泡和卵母細(xì)胞直徑以及發(fā)育同步化程度不是性成熟前小鼠卵母細(xì)胞發(fā)育能力差的因素。

⑧小鼠體外成熟卵母細(xì)胞SrCl₂最佳激活濃度為20mmol/L，這一濃度的孤雌激活率和囊胚發(fā)育率最高。

（曹新燕）