必 備 知 識

一、實驗室的設計原則與總體要求

植物組織培養是一項技術性較強的工作。為了確保植物組織培養工作的順利進行，在進行植物組織培養之前，不論是以實驗為目的還是以工廠化生產為目的，首先應對工作中需要哪些最基本的設備條件有較為全面的了解，便于以后工作的開展。

（一）設計原則

（1）防止污染。控制住污染，就等于組織培養成功了一半。

（2）按照工藝流程科學設計，經濟、實用和高效。

（3）結構和布局合理，工作方便，節能、安全。

（4）規劃設計與工作目的、規模及當地條件等相適應。

（二）總體要求

（1）實驗室選址要求避開污染源，例如最好避免與溫室、微生物實驗室、昆蟲實驗室等相鄰。水電供應充足，交通運輸便利。

（2）保證實驗室環境清潔。實驗室潔凈，可從根本上有效控制污染。這是組織培養工作的最基本要求，否則會使植物組織培養工作遭受不同程度甚至是不可挽回的損失。因此，過道和設備防塵、外來空氣的過濾裝置等設計是必要的。

（3）實驗室建造時，應采用產生灰塵量最少的建筑材料；墻壁和天花板、地面的交界處宜做成弧形，便于日常清潔；管道要盡量暗裝，安排好暗敷管道的走向，便于日后的維修，并能確保在維修時不造成污染；洗手池、下水道的位置要適宜，不得對培養環境造成污染，下水道開口位置應對實驗室的潔凈度影響最小，并有避免污染的措施；設置防止昆蟲、鳥類、鼠類等動物進入的設施。

（4）接種室、培養室的裝修材料還須經得起消毒、清潔和沖洗，并設置能確保與其潔凈度相應的控溫、控濕設施。

（5）實驗室電源應由專業部門設計、安裝并經驗證合格之后，方可使用。應有備用電源，確保停電或掉電時能繼續操作。

（6）實驗室必須滿足實驗準備（器皿的洗滌與存放、培養基制備和無菌操作、用具的滅菌）、無菌操作和控制培養三項基本工作的需要。

（7）實驗室各分室的大小、比例要合理。一般要求培養室與其他分室（除馴化室外）的面積之比為3∶2；培養室的有效面積（即培養架所占面積，一般占培養室總面積的2/3）與生產規模相適應。

（8）明確實驗室的采光、控溫方式，應與氣候條件相適應。一般采用人工光照和恒溫控制，實驗室為密封式或半地下式。

二、實驗室的基本組成

實驗室的基本組成如圖1-1所示。

G—藥品柜、儀器柜、器皿柜；T—實驗臺；B—冰箱；H—烘箱；S—水槽；R—熱空氣消毒箱；

m—高壓滅菌器；Q—人工氣候箱；C—超凈工作臺；P—培養架子；K—空調

（一）基本實驗室

基本實驗室包括準備室、滅菌室、緩沖間、無菌操作室、培養室，是組織培養實驗所必須具備的基本條件。如進行工廠化生產，年產組培苗4萬～20萬，需3～4間實驗用房，總面積60m²。

1．準備室

（1）主要功能　用于玻璃器皿和實驗用具的洗滌、干燥和貯存；培養材料的預處理與清洗；組培苗（也稱試管苗）的出瓶、清洗與整理，培養基的配制、植物材料的預處理等。

（2）設計要求　小型實驗室面積一般為10～20m²。要求房間寬敞明亮、通風、干燥、清潔衛生，方便多人同時工作；有電源、自來水和水槽（池），上下水道暢通；地面耐濕、防滑、排水良好，便于清潔。

（3）儀器與用具配置　工作臺、烘箱、晾干架、周轉筐（塑料或鐵制）、各種規格的毛刷、藥品柜、電子分析天平、托盤天平、磁力攪拌器、蒸餾水器、酸度計、恒溫水浴鍋、電爐（或微波爐、電飯煲、液化氣爐灶等）、培養基灌裝機、普通冰箱、低溫冰箱（低于－20℃）等儀器設備；移液管（或微量移液器）、移液管架、培養瓶（包括試管）、棕色或透明試劑瓶、燒杯（帶刻度或不帶刻度）、量筒、容量瓶、培養皿、吸管、皮下注射器、打孔器、玻璃棒、標簽紙、記號筆、耐高溫高壓塑料薄膜等封口材料、尼龍繩、脫脂棉、紗布、工作臺、蒸餾水桶、醫用小推車等用品和用具。此外，配備器械柜和藥品柜，分別存放接種用具和分類存放化學試劑。最好配備防塵設備，以減少灰塵污染。

2．滅菌室

（1）主要功能　用于培養基、器皿、工具和其他物品的消毒滅菌。

（2）設計要求　專用的小滅菌室面積一般為5～10m²。要求安全、通風、明亮；墻壁和地面防潮、耐高溫；配備水源、水槽（池）、電源或煤氣加熱裝置和供排水設施；保證上下水道暢通，通風措施良好。生產規模較小時，可與洗滌室、配制室合并在一起，但滅菌鍋的擺放位置要遠離天平和冰箱，而且必須設置換氣窗或換氣扇，以利通風換氣。

（3）儀器與用具配置　壓力滅菌鍋、干熱消毒柜或烘箱、細菌過濾裝置、工作臺、培養基存放架或櫥柜、周轉筐、換氣扇、醫用小推車等。

3．緩沖間

（1）主要功能　防止帶菌空氣直接進入接種室和工作人員進出接種室時帶進雜菌。接種人員在緩沖間更衣、換鞋、洗手、戴上口罩后，才能進入接種室。

（2）設計要求　面積不宜太大，一般在2～3m²。要求空間潔凈，墻壁光滑平整，地面平坦無縫，并在緩沖間和接種室之間用玻璃隔離，配置平滑門，以便于觀察、參觀和減少開關門時的空氣擾動。空間安裝1～2盞紫外光燈，用以接種前的照射滅菌；配備電源、自來水和小洗手池，備有鞋架、拖鞋和衣帽掛鉤，分別用于接種前洗手、擺放拖鞋和懸掛已滅過菌的工作服。

（3）儀器與用具配置　紫外光燈、小洗手池、擱架、鞋架、衣帽鉤、拖鞋、工作服、實驗帽和口罩等。

4．接種室

（1）主要功能　進行植物材料的接種、培養物的轉移等無菌操作，因此接種室也稱為無菌操作室。其無菌條件的好壞對組織培養的成功與否起著重要作用。

（2）設計要求　接種室不宜設在易受潮的地方。其大小根據實驗需要和環境控制的難易程度而定。在工作方便的前提下，宜小不宜大，小的接種室面積5～7m²即可。接種室要求密閉、干爽安靜、清潔明亮；塑鋼板或防菌漆的天花板、塑鋼板或白瓷磚的墻面光滑平整，不易積染灰塵；水磨石或水泥地面平坦無縫，便于清洗和滅菌。配備電源和平滑門窗，要求門窗密封性好；在適當的位置吊裝紫外光燈，保持環境無菌或低密度有菌狀態；安置空調機，實現人工控溫，這樣可以緊閉門窗，減少與外界空氣對流。接種室與培養室通過傳遞窗相通。最好進出接種室的人流、物流分開。

（3）儀器與用具配置　超凈工作臺、空調機、解剖鏡、接種器具消毒器（或高溫焚化爐）、紫外光燈、酒精燈、廣口瓶、三角瓶、搪瓷盤、接種工具、手持噴霧器、工作臺、擱架、接種用的小平車、不銹鋼長方形飯盒（盛放70%～75%酒精，用于浸泡接種工具）或醫院用消毒盒等。配置污物桶，以便存放接種過程中的丟棄物，須每天清洗更換。

5．培養室

（1）主要功能　培養離體材料。

（2）設計要求　培養室的設計應從以下幾方面考慮。

① 培養室的大小可根據生產規模和培養架的大小、數目及其他附屬設備而定。每個培養室不宜過大，面積10～20m²即可，以便于對條件的均勻控制。其設計以充分利用空間和節省能源為原則，最好設在向陽面或在建筑的朝陽面設計雙層玻璃墻，或加大窗戶，以利于接收更多的自然光線，窗的高度比培養架略高為宜。培養室外最好有緩沖間或走廊。

② 能夠控制光照和溫度。通常根據培養過程中是否需光，設計成光照培養室和暗培養室；材料的預培養、熱處理脫毒或細胞培養、原生質體培養等在光照培養箱或人工氣候箱內進行。采用光照時控器控制光照時間。

采用空調機調控培養室內的溫度。培養室面積較小時，采用窗式或柜式的冷暖型空調；培養室面積較大時，最好采用中央空調，以保證培養間內各部位溫度相對均衡。

③ 保持整潔，防止微生物感染。要求天花板、墻壁光滑平整、絕熱防火，最好用塑鋼板或瓷磚裝修；地面用水磨石或瓷磚鋪設，平坦無縫，方便室內消毒，并有利于反光，提高室內亮度。

④ 擺放培養架，以立體培養為主。培養架要求使用方便、節能、充分利用空間和安全可靠。一般設六層，高度2m，最下一層距地面0.2m，最上一層高1.7m，層間距為30cm，架寬0.6m，架長以40W日光燈管的長度來決定，每個培養架安裝2～3盞日光燈，多個培養架共用1個光照時控器。安裝日光燈時最好選用電子整流器，以降低能耗。架材最好用帶孔的新型角鋼條，可使擱板上下隨機移動。

⑤ 能夠通風、降濕、散熱。培養室的門窗密封性要好，有條件的可用玻璃磚代替窗戶，并安裝排氣扇，以備在濕度高、空調有故障時可以打開排氣扇通風排氣、散熱。南方濕度高的地方可以考慮在培養室內安裝除濕機。

⑥ 培養室外應設有緩沖間或走廊。

⑦ 培養室內用電量大，應設置供電專線和配電設備，并且配電板置于培養室外，保證用電安全和方便控制。

此外，為適應液體培養的需要，在培養室內配備搖床和轉床等設備，但要注意在大型搖床下面應有堅實的底座固定，以免搖床移位或因振動大而影響培養車間內的其他靜止培養。

（3）儀器與用具配置　空調機、排氣扇、搖床、轉床、光照培養箱或人工氣候箱、除濕機、光照時控器、干濕溫度計、溫度自動記錄儀及最高最低溫度記錄儀、培養架、日光燈、工作臺、配電盤等。

6．馴化棚室

（1）主要功能　進行組培苗的馴化移栽。

（2）設計要求　組培苗的馴化移栽通常在溫室或塑料大棚內進行。其面積大小視生產規模而定。要求環境清潔無菌，具備控溫、保濕、遮陰、防蟲和采光良好等條件。

（3）儀器與用具配置　具備彌霧裝置、遮陽網、暖氣或地熱線、移栽床（固定式或活動式）等設施；塑料缽、花盆、穴盤等移栽容器；草炭、沙子等移栽基質。

（二）輔助實驗室

根據研究或生產的需要而配套設置的專門實驗室，主要用于細胞學觀察和生理生化分析等。

1．細胞學實驗室

功能：用于對培養物的觀察分析與培養物的計數，對培養材料進行細胞學鑒定和研究，由制片室和顯微觀察室組成。制片是獲取顯微觀察數據的基礎，應配備有切片機、磨刀機、恒溫箱及樣品處理和切片染色的設備。應有通風柜和廢液處理設施。顯微觀察室主要有顯微鏡和圖像拍攝、處理設備。

要求：明亮、清潔、干燥，防止潮濕和灰塵污染。

設備：雙筒實體顯微鏡、顯微鏡、倒置顯微鏡等。

2．生化分析實驗室

功能：以培養細胞產物為主要目的的實驗室，應建立相應的分析化驗實驗室，隨時對培養物成分進行取樣檢查。大型次生代謝物生產，還需有效分離實驗室。

三、主要用具及儀器設備

（一）儀器設備

1．超凈工作臺

超凈工作臺原用于半導體元件與精密儀器儀表的生產，現已成為植物組織培養中最常用的無菌操作裝置。優點是操作方便自如，比較舒適，工作效率高，準備時間短。紫外滅菌20～30min即可操作，可進行長時間使用。在工廠化生產中，接種工作量很大，需要經常、長久地工作，超凈臺是很理想的設備。超凈工作臺功率在145～260W，裝有小型鼓風機，使空氣穿過一個前置過濾器，在這里把大部分空氣塵埃先過濾掉，然后再使空氣穿過一個細致的高效過濾器，除去了大于0.3μm的塵埃、細菌和真菌孢子等，最后以較潔凈的氣流吹到工作臺面。超凈空氣的流速為每分鐘24～30m，這已足夠防止附近空氣襲擾而引起的污染，這樣的流速也不會妨礙采用酒精燈對器械等進行灼燒消毒。在這樣的無菌條件下操作，就可以保證無菌材料在轉移接種過程中不受污染。超凈工作臺分水平式和垂直式兩種，又有單人、雙人、三人等類型。

2．無菌手套箱（接種箱）

接種箱可以自制也可購買，前面有玻璃便于觀察，左右兩側各有一孔，孔內有一手套袖，避免污染。兩側有拉門。在投資少的情況下，可以用接種箱來代替超凈工作臺。接種箱依靠密閉、藥劑熏蒸和紫外燈照射來保證內部空間無菌。但操作活動受限制，準備時間長，工作效率低。

3．空調機

接種室和培養室的室溫保證都需要空調機，空調機應安置在室內較高的位置，以便于排熱散涼。

4．除濕機和加濕器

培養室的相對濕度應為70%～80%。濕度過高，易長雜菌；濕度過低，培養器皿內的培養基會失水變干，影響培養物的生長。

5．恒溫箱

恒溫箱用于植物材料的培養，可以控制溫度、濕度及光照等。有條件的話，可選擇全自動的人工氣候箱。

6．烘箱

烘箱用于干燥洗凈的玻璃器皿，也可用于干熱滅菌和測定干物重。用于干燥需保持80～100℃；進行干熱滅菌需保持150℃，達1～3h；若測定干物重，則溫度應控制在80℃，烘至完全干燥為止。

7．高壓滅菌鍋

高壓滅菌鍋是植物組織培養中最基本的設備之一，用于進行培養基和器械用具的滅菌。小規模實驗室可選用小型手提式高壓滅菌鍋。如果是連續的大規模生產，應選用大型立式的或臥式的高壓滅菌鍋，通常以電作能源。

8．冰箱

冰箱分為普通冰箱和低溫冰箱。主要用于貯存母液，各種易變質、易分解的化學藥品以及植物材料等。

9．電子分析天平和托盤天平

電子分析天平，用于稱取大量元素、微量元素、維生素、激素等微量藥品，精確度為0.0001g；托盤天平用于稱取用量較大的糖和瓊脂等，其精確度為0.1g。天平應放置在干燥、不受震動的天平操作臺上。

10．顯微鏡及解剖鏡

顯微鏡及解剖鏡種類較多，用于分離微莖尖可采用雙筒實體解剖鏡。雙筒解剖鏡在分離莖尖等較小組織時，便于觀察、操作，通常放大5～80倍。放大40倍以上的操作需要有相當熟練的技術和較好的工具。為進行操作，要有照明裝置。解剖鏡上帶有照相裝置，根據需要隨時對所需材料進行攝影記錄。

11．水浴鍋

水浴鍋用于溶解難溶藥品和熔化瓊脂條。

12．搖床與轉床

搖床與轉床用于改善液體培養材料的通氣狀況及促進酶解原生質體的解離。一般在液體培養中轉速為每分鐘100次左右，在解離原生質體時為每分鐘80次左右。

13．磁力攪拌器

磁力攪拌器用于加速攪拌難溶的物質，如各種化學物質、瓊脂粉等。磁力攪拌器還可加熱，使之更利于溶解。

14．電蒸餾水器

電蒸餾水器采用硬質玻璃或金屬制成。蒸餾水用于配制母液或培養基，配制培養基可用自來水來代替，若實驗要求嚴格的話，則須用蒸餾水。

15．酸度計

組織培養中培養基pH值的準確度是十分重要的，應當使用酸度計；若無酸度計，也可使用pH試紙進行粗測。

首次使用酸度計前，應用標準液調節定位，然后固定。測量pH值時，待測液必須充分攪拌均勻。如果培養基溫度過高，測量時要調整pH值計上的溫度鈕使之和培養基溫度相當。注意保護好玻璃電極，用后電極應用蒸餾水沖洗凈，蓋上電極帽。

16．離心機

離心機用于收集原生質體，轉速要求較低。一般為1000～4000r/min即可。

17．培養基分裝器

將配制好的培養基分裝于試管，為了節省時間和避免浪費，在工廠化組配車間，可用培養基分裝器進行灌裝。

18．電爐等加熱設備

電爐等加熱設備用于固體培養基配置時溶解瓊脂，可選擇電爐、電磁爐、微波爐等。

（二）各類器材

1．培養器皿

在組織培養中配制培養基和進行培養時需用大量的玻璃器皿。其要求由堿性溶解度小的硬質玻璃制成，以保證長期貯存藥品及培養的效果；培養用的還要求透光度好，能耐高壓、高溫，能方便地放入培養基和培養材料，根據培養的目的和要求，可以采用不同種類、規格的玻璃器皿。其中以試管、三角瓶、培養皿等使用較多。

最常使用的是三角瓶，規格有100mL、250mL、500mL等。一般使用100mL三角瓶，無論靜止或振蕩培養皆適用。其培養面積大，利于組織生長，受光也比試管好，且瓶口較小，亦不易污染。

培養皿常用90mm、120mm直徑等規格，要求上、下能密切吻合。它在游離細胞、原生質體、花粉等的靜置培養、看護培養，無菌種子的發芽，植物材料的分離等過程中都要用到。

試管常用18mm×180mm或20mm×200mm規格。可用于培養較高的試管苗，另外也不易污染。

培養器皿還可就地取材，采用一些代用品。工廠化生產可采用廣口的200mL罐頭瓶，加蓋半透明的塑料蓋，由于瓶口大，所以大量繁殖時操作方便、工作效率高，也減少了培養材料的損傷。但缺點是易引起污染。

目前，培養容器和制備培養基所用的玻璃器皿逐漸被塑料器皿所代替。塑料容器具有質輕、透明、不易破碎、成本低等優點。如培養容器多為平底方盒形，能一層層地疊摞起來，從而節省空間。這類塑料制品多是采用聚丙烯材料制成，能耐高溫，可進行高壓滅菌。有些產品為一次性消耗品，不但可節省洗滌人工，還可節省時間，提高效率。一次性塑料容器或帶螺絲帽的玻璃瓶，無須另外配蓋，使用時比較方便。

瓶口封塞可用多種方法，但要具有一定的通氣性和密閉性，以防止培養基干燥和雜菌污染。以前封口常用棉塞，這種封口辦法夏季極易污染，且不易保持培養基的濕度。現在多采用聚丙烯塑料薄膜作為封口，以線繩結扎或橡皮圈箍扎。為了增加通氣性，可在里面襯一層硫酸紙或牛皮紙，經濟方便，且通氣好。也可采用專用的封口膜。

2．分注器

小型操作時可采用燒杯直接分裝。大型實驗室可采用醫用“下口杯”作為分裝工具，在“下口杯”的下口管上套一段軟膠管，加一個彈簧止水夾，使用時非常方便。更大規模或要求更高效率時，可考慮采用液體自動定量灌注設備。

3．離心管

離心管用于離心收集原生質體，一般用5mL、10mL規格。

4．刻度移液管

刻度移液管常用的有0.1mL、0.2mL、0.5mL、2mL、5mL、10mL，用于配制培養基時吸取不同種類的母液。應多準備幾支，分開使用。

5．細菌過濾器

培養基中有些生長調節物質以及有機附加物，如吲哚乙酸、赤霉素等，在高溫條件下易被分解破壞，可用細菌過濾器除去不能采用濕熱滅菌法的液體中的細菌。一般采用0.22μm微孔濾膜進行抽濾滅菌。包括濾頭、注射器或采用抽濾裝置（真空泵、吸濾瓶、濾氣玻璃管等）。

6．實驗器皿

在組織培養中配制培養基、貯藏母液、材料的消毒等需要用到的各種化學實驗玻璃器皿，包括100mL、250mL、500mL、1000mL的燒杯，10mL、100mL、1000mL的量筒，100mL、1000mL的試劑瓶（棕色）等。

（三）器械用具

1．鑷子類

常應用醫療上的鑷子。根據操作需要有各種類型，若用100mL的三角瓶作為培養瓶，可用20cm長的鑷子。鑷子過短，容易使手接觸瓶口，造成污染；鑷子太長，使用起來不靈活。如在分離莖尖幼葉時，則用鐘表鑷子。

2．剪刀類

可采用醫療五官科用的中型剪刀，主要用于切斷莖段、葉片等；也可以用彎形剪刀，由于其頭部彎曲，可以深入到瓶口中進行剪切。

3．解剖刀

切割較小材料和分離莖尖分生組織時，可用解剖刀。刀片要經常調換，使之保持鋒利狀態，否則切割時會造成擠壓，引起周圍細胞組織大量死亡，影響培養效果。

4．解剖針

解剖針可深入到培養瓶中，轉移細胞或愈傷組織，也可用于分離微莖尖的幼葉。可以自制。

5．接種工具

接種工具包括接種針、接種鉤及接種鏟，由白金絲或鎳絲制成。

6．鉆孔器

鉆孔器常在取肉質莖、塊莖、肉質根內部的組織時采用。一般為“T”字形，口徑有各種規格。

7．其他

其他包括酒精燈、電爐、試管架、搪瓷盤、玻璃棒等多種。

四、實驗室的管理

（一）洗滌

1．器皿的清洗

植物組織培養中對各種培養器皿要求洗滌清潔，以防止帶入有毒物或影響培養效果的化學物質或微生物等，對那些常用的玻璃器皿的清潔要求更為嚴格。清洗玻璃器皿用的洗滌劑主要有肥皂、洗潔精、洗衣粉和鉻酸洗滌劑（由重鉻酸鉀和濃硫酸混合而成）。新購置的器皿，先用1%的稀鹽酸浸泡，后用肥皂水洗凈，清水沖洗，再用蒸餾水淋一遍。用過的器皿，先要除去其上的殘渣，再用試管刷沿壁上下刷動和旋轉刷洗。刷后用清水沖洗，再用肥皂水或洗滌劑洗凈，再用清水徹底沖洗干凈，最后用蒸餾水沖洗一遍，干后備用。已被污染的器皿則必須在高壓滅菌后，用肥皂水或洗滌劑洗凈，再用清水沖洗干凈后，用蒸餾水沖洗一遍，干后備用。洗好的瓶子應該透明光亮，內外壁水膜均勻，不掛水珠。

移液管之類的儀器，可用洗耳球和熱洗衣粉水吸洗，再放在水龍頭下流水徹底沖凈，垂直放置晾干后使用。

2．金屬用具的清洗

新購置的金屬用具表面有一層油脂，需擦凈后再用肥皂水洗凈，清水沖洗干凈后，擦干備用。用過的金屬用具，清水沖洗干凈后，擦干備用即可。

（二）滅菌

滅菌是進行植物組織培養的關鍵環節之一，包括對植物材料、培養基、器皿器械、實驗室等的滅菌。不同的滅菌對象所采用的滅菌方法也不同，可參見表1-1。

現介紹幾種常用的滅菌方法。

1．干熱滅菌

干熱滅菌是適用于玻璃器皿和金屬器械的滅菌方法，即利用烘箱或熱空氣消毒箱等加熱到160～180℃，1～3h殺死微生物的方法。但由于此方法滅菌時能源消耗大、時間長，所以一般不常用。

2．濕熱滅菌

濕熱滅菌是植物組織培養中最常用的滅菌方法，即利用高壓滅菌鍋滅菌的方法，適用于培養基、玻璃器皿、金屬器械、布制品等的滅菌。通常滅菌溫度121℃，壓力108kPa，20～30min。

3．熏蒸滅菌

為了確保無菌室和培養室無菌，每年要進行1～2次熏蒸滅菌。對無菌室可以直接熏蒸。對培養室進行熏蒸時，須將培養物取出放置于無菌環境下，待熏蒸滅菌完成后用75%的酒精棉球擦拭培養瓶后方能將其放入培養室。具體方法是用甲醛和高錳酸鉀或乙二醇加熱熏蒸，用量一般是每立方米用甲醛2mL、高錳酸鉀1g或用乙二醇6mL。

（三）準備室及滅菌室的管理

保證房間干燥、清潔衛生，藥品管理要有專門的藥品柜，各種藥品要求合理擺放，最好建立入柜登記制度，做到同一藥品先入先出。各類器皿使用后要按照規范洗滌干凈后放入藥品柜存放。小型儀器使用后也要求清理干凈后入柜。

（四）無菌室及培養室的管理

無菌室及培養室要求清潔并無菌。可采用每年1～2次熏蒸滅菌及75%酒精擦拭地面及臺面的方式滅菌。