工作任務

任務1　初代培養

子任務1-1　離體根的初代培養

一、工作目標

了解離體根培養的方法和步驟。熟練外植體的選擇、消毒、接種等操作過程。完成離體根的初代培養過程、熟練無菌操作規程。

二、材料用具

超凈工作臺、高壓滅菌鍋、電磁爐、無菌打孔器、無菌培養皿、酒精燈、接種工具、刮皮刀、無菌瓶、燒杯（500mL）、無菌濾紙、玻璃棒、火柴、記號筆、紗布、70%乙醇、胡蘿卜肉質根、母液、培養瓶、移液管、95%乙醇、飽和漂白粉、0.1%氯化汞、無菌水等。

三、工作過程

1．外植體選擇與處理

取健壯的胡蘿卜肉質根，用自來水沖凈，用刮皮刀削去外層組織1～2mm厚，橫切成10mm厚的切片，然后在超凈工作臺上將胡蘿卜切片放入無菌瓶中，用70%乙醇處理幾秒，無菌水沖洗一次，用飽和漂白粉溶液浸泡10min，無菌水漂洗3～4次，每次30～60s。將胡蘿卜切片平放在無菌培養皿中，一只手用鑷子固定胡蘿卜片，另一只手用打孔器沿形成層區域垂直鉆取圓柱體若干，然后用玻璃棒輕輕將圓柱體從打孔器中推出，放入裝有無菌水的培養皿中。反復操作，直到達到接種數量要求。

2．接種

從培養皿中取出胡蘿卜圓柱體，放在無菌培養皿中，用解剖刀切除圓柱體兩端各2mm的組織，然后將余下部分分切成3片（每片約2mm厚，小圓片直徑5mm），用無菌濾紙吸干圓片兩面的水分，然后左手握住培養瓶，用火焰燒瓶口和封口材料，用右手的拇指和小指打開瓶蓋，當打開瓶子時，瓶口朝向酒精燈火焰，并拿成斜角，以免灰塵落入瓶中造成污染。用鑷子將胡蘿卜片接種到培養基（為預先配制的誘導愈傷組織培養基，初代培養基配方為MS＋IAA 1.0mg/L＋KT 0.1mg/L）中，用酒精燈灼燒一下瓶口和瓶蓋，然后蓋嚴，進行培養。同時操作期間經常用70%乙醇擦拭雙手和臺面，并經常進行接種工具的滅菌，避免交叉污染。

3．培養

置于25℃恒溫箱中暗培養。接種幾天后，外植體表面開始變得粗糙，有許多光亮點出現（這是愈傷組織開始形成的表現），3～4周后形成大量愈傷組織。

4．觀察記錄

跟蹤觀察記錄產生愈傷組織和不定芽的時間以及出愈率、分化率和污染率等技術指標，及時淘汰劣苗、污染苗。

四、注意事項

（1）外植體要求無病、健壯。

（2）用打孔器鉆取胡蘿卜根時必須打穿組織。

（3）嚴守無菌操作規程。

五、考核內容與評分標準

1．相關知識

（1）接種過程中的注意事項（20分）。

（2）常規滅菌方法（20分）。

2．操作技能

（1）熟練掌握外植體選擇、滅菌技術（30分）。

（2）熟練掌握外植體接種技術（30分）。

子任務1-2　馬鈴薯莖尖初代培養

一、工作目標

了解莖尖初代培養的方法和步驟。熟練掌握外植體的取材、消毒、接種、初代培養的操作過程。掌握植物莖尖的初代培養方法。

二、材料用具

超凈工作臺、高壓滅菌鍋、電磁爐、解剖鏡、解剖刀、解剖針、長鑷子、培養皿、酒精燈、接種工具、無菌瓶、燒杯（500mL）、玻璃棒、火柴、記號筆、紗布、70%乙醇、75%乙醇母液、培養瓶、移液管、95%乙醇、0.1%氯化汞、馬鈴薯塊莖等。

三、工作過程

1．培養基配制

初代培養基采用MS＋GA₃ 0.1mg/L＋NAA 0.5mg/L＋6-BA 0.5mg/L，在初代培養前配制相應的固體培養基，并進行滅菌，備用。

2．外植體選擇與處理

馬鈴薯莖尖1～2cm，自來水沖洗30min，剝去外面的葉片。

3．外植體滅菌與接種

接種前，打開超凈臺紫外燈以及接種室紫外燈滅菌30min，30min后打開超凈臺鼓風，關閉紫外燈。在準備室用肥皂水清洗雙手，穿好經滅菌的實驗服并戴好口罩，進入接種室打開超凈臺的照明燈。用70%乙醇擦拭雙手和超凈工作臺臺面，并把滅菌的培養基用70%乙醇擦拭后放入超凈工作臺。

取出接種工具浸泡在盛有95%乙醇的罐頭瓶內，成套培養皿放在超凈臺面上。然后點燃酒精燈，按培養皿、接種工具的先后順序在火焰上分別滅菌，并將接種工具擺放在培養皿或器械架上。

然后將外植體材料放在超凈工作臺上進行消毒。先用75%的乙醇浸潤15s，然后用無菌水沖洗3～5次，再用0.1%的升汞浸泡8～10min，浸泡時可進行搖動，使植物材料和滅菌劑有良好的接觸，然后用無菌水漂洗3～5次。最后將處理過的材料放入滅過菌的培養皿中待用。在解剖鏡下一手拿鑷子，一手拿解剖刀，將已消毒的莖尖放在解剖鏡下，逐層剝去幼葉直至露出圓錐形生長點，用滅過菌的解剖刀切取長約0.3～0.5mm帶1～2個葉原基的莖尖，切面要平整。然后左手握住培養瓶，用火焰燒瓶口和封口材料，用右手的拇指和小指打開瓶蓋，當打開培養瓶時，瓶口朝向酒精燈火焰，并拿成斜角，迅速地將莖尖接種到MS＋GA₃ 0.1mg/L＋NAA 0.5mg/L＋6-BA 0.5mg/L培養基中，蓋上瓶蓋。同時操作期間經常用70%乙醇擦拭雙手和臺面，接種工具要反復在95%的乙醇中浸泡和在火焰上滅菌，避免交叉污染。

4．初代培養

將接種后的材料放入培養室內培養，培養條件為溫度23～27℃，光照1000～3000lx，16h/d。大約5～7d后莖尖轉綠，40～50d成苗。當新梢長出2～3cm長的腋芽時，在無菌條件下將無菌瓶苗剪成一段一芽，進行繼代培養。

5．觀察記錄

跟蹤觀察記錄產生愈傷組織和不定芽的時間以及出愈率、分化率和污染率等技術指標，及時淘汰劣苗、污染苗。

四、注意事項

（1）外植體要求采用無病、健壯植株的莖段。

（2）腋芽萌發后及時轉接到增殖培養基。

（3）嚴守無菌操作規程。

五、考核內容與評分標準

1．相關知識

（1）莖尖接種過程中的注意事項（20分）。

（2）莖尖滅菌方法（10分）。

（3）莖尖的剝離（20分）

2．操作技能

（1）熟練掌握外植體選擇、滅菌技術（10分）。

（2）熟練掌握外植體接種技術（10分）。

（3）熟練掌握培養基的配制滅菌（10分）。

（4）熟練掌握莖尖初代組織培養（10分）。

（5）熟練掌握莖尖剝離的方法（10分）

子任務1-3　莖段初代培養

一、工作目標

了解莖段培養的方法和步驟。熟練掌握外植體的取材、消毒、接種、初代培養等操作過程。熟練莖段的初代培養程及無菌操作規程。

二、材料用具

超凈工作臺、高壓滅菌鍋、電磁爐、無菌培養皿、酒精燈、接種工具、無菌瓶、燒杯（500mL）、玻璃棒、火柴、記號筆、紗布、70%乙醇、75%乙醇、矮牽牛莖段、母液、培養瓶、移液管、95%乙醇、0.1%氯化汞。

三、工作過程

1．培養基配制

初代培養基采用MS＋6-BA 0.3～1.0mg/L；在初代培養前配制相應的固體培養基，并進行滅菌，備用。

2．外植體選擇與處理

接種前，取生長健壯、無病蟲害的矮牽牛植株，剪取莖段，帶回實驗室，用剪刀剪去葉片和葉柄，用自來水沖洗，剪成帶節小段。

3．外植體滅菌與接種

接種前，打開超凈臺紫外燈以及接種室紫外燈滅菌30min，30min后打開超凈臺鼓風，關閉紫外燈。在準備室用肥皂水清洗雙手，穿好經滅菌的實驗服并戴好口罩，進入接種室打開超凈臺的照明燈。用70%乙醇擦拭雙手和超凈工作臺臺面，并把滅菌的培養基用70%乙醇擦拭后放入超凈工作臺。

取出接種工具浸泡在盛有95%乙醇的罐頭瓶內，成套培養皿放在超凈臺面上。然后點燃酒精燈，按培養皿、接種工具的先后順序在火焰上分別滅菌，并將接種工具擺放在培養皿或器械架上。

將剪好的矮牽牛小段裝入燒杯中，在超凈工作臺上，用75%乙醇處理30s，0.1%氯化汞8～10min，浸泡時可進行搖動，使植物材料和滅菌劑有良好的接觸，然后用無菌水漂洗 3～5次。取下鑷子、剪刀在酒精燈火焰上滅菌，然后一手拿鑷子，一手拿剪刀，將消毒好的莖段去除兩端被消毒劑殺傷的部位，再剪成一段一芽的小莖段。然后左手握住培養瓶，用火焰燒瓶口和封口材料，用右手的拇指和小指打開瓶蓋，當打開培養瓶時，瓶口朝向酒精燈火焰，并拿成斜角，以免灰塵落入瓶中造成污染。用鑷子將莖段接種到MS＋6-BA 0.3～1.0mg/L培養基中，蓋上瓶蓋。同時操作期間經常用70%乙醇擦拭雙手和臺面，接種工具要反復在95%的乙醇中浸泡和在火焰上滅菌，避免交叉污染。

4．初代培養

接種后培養瓶置于22～24℃，光強1500～2000lx，光照時間12h/d的培養室內培養。 2～3周后，從葉腋處長出1cm左右長的腋芽，在無菌條件下將無菌瓶苗剪成一段一芽，進行繼代培養。

5．觀察記錄

培養過程中跟蹤觀察，統計各項技術指標，及時分析并有效解決存在的問題，發現污染瓶及時清洗。

四、注意事項

（1）外植體要求采自無病、健壯植株。

（2）滅菌后接種前莖段兩端要剪掉。

（3）嚴守無菌操作規程。

五、考核內容與評分標準

1. 相關知識

（1）莖段接種過程中的注意事項（20分）。

（2）莖段滅菌方法（10分）。

（3）莖段初代組織培養的一般過程（20分）。

2．操作技能

（1）熟練掌握外植體選擇、滅菌技術（10分）。

（2）熟練掌握外植體接種技術（10分）。

（3）熟練掌握培養基的配制滅菌（10分）。

（4）熟練掌握莖段初代組織培養（20分）。

子任務1-4　離體葉的培養

一、工作目標

了解葉片培養的方法和步驟。熟練掌握外植體的取材、消毒、接種、初代培養等操作過程。

二、材料用具

超凈工作臺、高壓滅菌鍋、電磁爐、無菌培養皿、酒精燈、接種工具、無菌瓶、燒杯（500mL）、玻璃棒、火柴、記號筆、紗布、70%乙醇、75%乙醇、驅蚊草的葉片、母液、培養瓶、移液管、95%乙醇、0.1%氯化汞、無菌水等。

三、工作過程

1．培養基配制

初代培養基采用MS＋6-BA 0.3～1.0mg/L；在初代培養前配制相應的固體培養基，并進行滅菌，備用。

2．外植體選擇與處理

接種前，取生長健壯、無病蟲害的驅蚊草植株，剪取葉片，帶回實驗室，用自來水沖洗。

3．外植體滅菌與接種

接種前，打開超凈臺紫外燈以及接種室紫外燈30min，30min后打開超凈臺鼓風，關閉紫外燈。在準備室用肥皂水清洗雙手，穿好經滅菌的實驗服并戴好口罩，進入接種室打開超凈臺的照明燈。用70%乙醇擦拭雙手和超凈工作臺臺面，并把滅菌的培養基用70%乙醇擦拭后放入超凈工作臺。

取出接種工具浸泡在盛有95%乙醇的罐頭瓶內，成套培養皿放在超凈臺面上。然后點燃酒精燈，按培養皿、接種工具的先后順序在火焰上分別滅菌，并將接種工具擺放在培養皿或器械架上。

將處理好的驅蚊草的葉片裝入燒杯中，在超凈工作臺上，用75%乙醇處理30s，0.1%氯化汞5～6min，加入1～2滴吐溫-80，浸泡時可進行搖動，使植物材料和滅菌劑有良好的接觸，然后用無菌水漂洗3～5次。取下鑷子、剪刀在火焰上滅菌，然后一手拿鑷子、一手拿剪刀，用剪刀剪去葉緣和葉尖后，將葉片剪成0.5cm見方的小葉塊，然后左手握住培養瓶，用火焰燒瓶口和封口材料，用右手的拇指和小指打開瓶蓋，當打開培養瓶時，瓶口朝向酒精燈火焰，并拿成斜角，以免灰塵落入瓶中造成污染。用鑷子將消毒好的小葉塊接種到MS＋6-BA 0.3～1.0mg/L培養基中，一般要求葉背面朝上平放培養基上，蓋上瓶蓋。同時操作期間經常用70%乙醇擦拭雙手和臺面，接種工具要反復在95%的乙醇中浸泡和在火焰上滅菌，避免交叉污染。

4．初代培養

接種后培養瓶置于25℃、光強1000～1500lx、光照16h/d的培養室內培養。4周后陸續有不定芽產生。

5．觀察記錄

跟蹤觀察記錄產生愈傷組織和不定芽的時間以及出愈率、分化率和污染率等技術指標，及時淘汰劣苗、污染苗。

四、注意事項

（1）注意葉片的分切部位與分切方法。

（2）根據葉片的幼嫩程度合理選擇消毒劑和確定適宜的滅菌時間，防止消毒過度。

（3）接種時，接種工具灼燒滅菌后要充分冷涼后再接種，防止造成葉片、葉柄燙傷。

（4）注意把握愈傷組織分化時機。

五、考核內容與評分標準

1．相關知識

（1）葉片接種過程中的注意事項（20分）。

（2）葉片滅菌方法（30分）。

2．操作技能

（1）熟練掌握外植體選擇、滅菌技術（10分）。

（2）熟練掌握外植體接種技術（20分）。

（3）熟練掌握培養基的配制滅菌（10分）。

（4）熟練掌握葉片組織培養（10分）。

子任務1-5　胚初代培養

一、工作目標

了解胚培養的方法和步驟。熟練掌握外植體的取材、消毒、接種、初代培養等操作過程。熟練掌握胚的初代培養過程。

二、材料用具

超凈工作臺、高壓滅菌鍋、電磁爐、無菌培養皿、酒精燈、接種工具、無菌瓶、燒杯（500mL）、玻璃棒、火柴、記號筆、紗布、70%乙醇、75%乙醇、蘋果種子、12%～14%次氯酸鈉溶液、母液、培養瓶、移液管、95%乙醇、無菌水等。

三、工作過程

1．培養基配制

初代培養基為MS＋6-BA 0.5～1.0mg/L＋IAA 0.05～0.2mg/L；在初代培養前配制相應的固體培養基，并進行滅菌，備用。

2．外植體選擇與處理

將經層積處理的成熟飽滿的蘋果種子在蒸餾水中浸泡12h。

3．外植體滅菌與接種

接種前，打開超凈臺紫外燈以及接種室紫外燈滅菌30min，30min后打開超凈臺鼓風，關閉紫外燈。在準備室用肥皂水清洗雙手，穿好經滅菌的實驗服并戴好口罩，進入接種室打開超凈臺的照明燈。用70%乙醇擦拭雙手和超凈工作臺臺面，并把滅菌的培養基用70%乙醇擦拭后放入超凈工作臺。

取出接種工具浸泡在盛有95%乙醇的罐頭瓶內，成套培養皿放在超凈臺面上。然后點燃酒精燈，按培養皿、接種工具的先后順序在火焰上分別滅菌，并將接種工具擺放在培養皿或器械架上。然后將外植體材料在超凈工作臺上用75%的乙醇浸泡10s，再用12%～14%的次氯酸鈉消毒15min，最后用無菌水沖洗3次。浸泡時可進行搖動，使植物材料和滅菌劑有良好的接觸。將1粒種子置于無菌培養皿中，用鑷子夾住，用解剖刀先將種皮劃破，再用另一把鑷子輕輕把種皮剝去，然后用解剖刀沿胚胎的邊緣小心地剝去胚乳。分離出胚后，用無菌水將每1個胚沖洗3次，然后左手握住培養瓶，用火焰燒瓶口和封口材料，用右手的拇指和小指打開瓶蓋，當打開培養瓶時，瓶口朝向酒精燈火焰，并拿成斜角，以免灰塵落入瓶中造成污染。用鑷子將消毒好的胚接種到MS培養基中，蓋上瓶蓋。同時操作期間經常用70%乙醇擦拭雙手和臺面，接種工具要反復在95%的乙醇中浸泡和在火焰上滅菌，避免交叉污染。

4．初代培養

將培養瓶置于黑暗中培養，保持溫度25℃，3～4d后轉入光下培養，觀察其生長狀況。

5．觀察記錄

跟蹤觀察記錄產生愈傷組織和不定芽的時間，以及出愈率、分化率和污染率等技術指標，及時淘汰劣苗、污染苗。

四、注意事項

（1）剝離胚時一定要細心謹慎，盡量使胚完整無損傷。

（2）注意觀察胚的位置和成熟度。

五、考核內容與評分標準

1．相關知識

（1）胚剝離過程中的注意事項（20分）。

（2）外植體滅菌方法（10分）。

（3）胚組織初代培養的一般過程（20分）

2．操作技能

（1）熟練掌握外植體選擇、滅菌技術（10分）。

（2）熟練掌握外植體接種技術（10分）。

（3）熟練掌握培養基的配制滅菌（20分）。

（4）熟練掌握胚組織培養（10分）。

子任務1-6　花藥初代培養

一、工作目標

了解花藥培養的方法和步驟。熟練掌握外植體的取材、消毒、接種、初代培養等操作過程。掌握花藥的初代培養過程、熟練無菌操作規程。

二、材料用具

超凈工作臺、高壓滅菌鍋、電磁爐、無菌培養皿、酒精燈、接種工具、無菌瓶、燒杯（500mL）、玻璃棒、火柴、記號筆、紗布、70%乙醇、75%乙醇、大花萱草花蕾、0.1%升汞、5%次氯酸鈉、母液、培養瓶、移液管、95%乙醇、無菌水等。

三、工作過程

1．培養基配制

初代培養基：MS＋NAA 5.0mg/L＋KT 0.5mg/L；在初代培養前配制相應的固體培養基，并進行滅菌，備用。

2．外植體選擇與處理

開花前3～5d，從生長正常、無病蟲害的大花萱草植株上剪下帶花梗的花蕾，流水沖洗0.5～1h后備用。

3．外植體滅菌與接種

接種前，打開超凈臺紫外燈以及接種室紫外燈滅菌30min，30min后打開超凈臺鼓風，關閉紫外燈。在準備室用肥皂水清洗雙手，穿好經滅菌的實驗服并戴好口罩，進入接種室打開超凈臺的照明燈。用70%乙醇擦拭雙手和超凈工作臺臺面，并把滅菌的培養基用70%乙醇擦拭后放入超凈工作臺。取出接種工具浸泡在盛有95%乙醇的罐頭瓶內，成套培養皿放在超凈臺面上。然后點燃酒精燈，按培養皿、接種工具的先后順序在火焰上分別滅菌，并將接種工具擺放在培養皿或器械架上。然后在超凈工作臺上進行花蕾表面消毒。具體方法是：先用75%的乙醇浸泡30s，再用0.1%升汞浸泡6min，最后用無菌水沖洗3～5次，用無菌濾紙吸干水分。浸泡時可進行搖動，使植物材料和滅菌劑有良好的接觸。用接種工具去除花梗，剝掉花被，最后取出花藥，接種于MS＋NAA 5.0mg/L＋KT 0.5mg/L初代培養基上。同時操作期間經常用70%乙醇擦拭雙手和臺面，接種工具要反復在95%的乙醇中浸泡和在火焰上滅菌，避免交叉污染。

4．初代培養

接種后置于25℃、光照10～12h/d、光強1500～2000lx的條件下培養。

5．觀察記錄

跟蹤觀察記錄產生愈傷組織和不定芽的時間以及出愈率、分化率和污染率等技術指標，及時淘汰劣苗、污染苗。

四、注意事項

（1）用鑷子夾取花藥時力度要小，子房要豎直插入培養基。

（2）注意花蕾的采集時間。

五、考核內容與評分標準

1．相關知識

（1）花藥剝離過程中的注意事項（20分）。

（2）外植體滅菌方法（10分）。

（3）花藥組織初代培養的一般過程（20分）。

2．操作技能

（1）熟練掌握外植體選擇、滅菌技術（10分）。

（2）熟練掌握外植體接種技術（10分）。

（3）熟練培養基的配制滅菌（20分）。

（4）熟練掌握花藥初代組織培養（10分）。

任務2　繼代培養

子任務2-1　愈傷組織繼代培養

一、工作目標

了解愈傷組織繼代培養的方法和步驟。熟練掌握繼代培養的操作過程。

二、材料用具

超凈工作臺、高壓滅菌鍋、電磁爐、解剖刀、長鑷子、培養皿、酒精燈、接種工具、燒杯（500mL）、玻璃棒、火柴、記號筆、紗布、70%乙醇、培養瓶、移液管、花藥愈傷組織等。

三、工作過程

1．培養基配制

繼代培養基采用N₆＋2，4-D 2.0mg/L，在繼代培養前配制相應的固體培養基，并進行滅菌，備用。

2．接種

接種前，打開超凈臺紫外燈以及接種室紫外燈滅菌30min，30min后打開超凈臺鼓風，關閉紫外燈。在準備室用肥皂水清洗雙手，穿好經滅菌的實驗服并戴好口罩，進入接種室打開超凈臺的照明燈。用70%乙醇擦拭雙手和超凈工作臺臺面，并把滅菌的培養基用70%乙醇擦拭后放入超凈工作臺。

取出接種工具浸泡在盛有95%乙醇的罐頭瓶內，成套培養皿放在超凈臺面上。然后點燃酒精燈，按培養皿、接種工具的先后順序在火焰上分別滅菌，并將接種工具擺放在培養皿或器械架上。

無菌條件下，左手握住愈傷組織培養瓶和接種瓶，用火焰燒瓶口和封口材料，打開無菌瓶苗瓶蓋，瓶口朝向酒精燈火焰，并拿成斜角，用解剖刀將愈傷組織切成小塊，然后打開接種瓶瓶蓋，用鑷子將愈傷組織接種到N₆＋2，4-D 2.0mg/L繼代培養基中，蓋好蓋進行培養。

3．觀察記錄

跟蹤觀察記錄產生愈傷組織和不定芽的時間以及出愈率、分化率和污染率等技術指標，及時淘汰劣苗、污染苗。

四、注意事項

（1）無菌操作規程。

（2）培養基滅菌。

（3）嚴守無菌操作規程。

五、考核內容與評分標準

1．相關知識

（1）愈傷組織接種過程中的注意事項（30分）。

（2）愈傷組織繼代方法（20分）。

2．操作技能

（1）熟練掌握愈傷組織接種（30分）。

（2）熟練掌握愈傷組織切割（10分）。

（3）熟練培養基的配制滅菌（10分）。

子任務2-2　瓶苗繼代培養

一、工作目標

了解瓶苗繼代培養的方法和步驟。熟練掌握瓶苗繼代培養的操作過程。

二、材料用具

超凈工作臺、高壓滅菌鍋、電磁爐、解剖刀、長鑷子、培養皿、酒精燈、接種工具、燒杯（500mL）、玻璃棒、火柴、記號筆、紗布、70%乙醇、培養瓶、移液管、瓶苗等。

三、工作過程

1．培養基配制

繼代培養基采用MS＋IAA 1.5mg/L，在繼代培養前配制相應的固體培養基，并進行滅菌，備用。

2．接種

接種前，打開超凈臺紫外燈以及接種室紫外燈滅菌30min，30min后打開超凈臺鼓風，關閉紫外燈。在準備室用肥皂水清洗雙手，穿好經滅菌的實驗服并戴好口罩，進入接種室打開超凈臺的照明燈。用70%乙醇擦拭雙手和超凈工作臺臺面，并把滅菌的培養基用70%乙醇擦拭后放入超凈工作臺。

取出接種工具浸泡在盛有95%乙醇的罐頭瓶內，成套培養皿放在超凈臺面上。然后點燃酒精燈，按培養皿、接種工具的先后順序在火焰上分別滅菌，并將接種工具擺放在培養皿或器械架上。

無菌條件下，左手握住無菌瓶苗的培養瓶和接種瓶，用火焰燒瓶口和封口材料，打開無菌瓶苗瓶蓋，瓶口朝向酒精燈火焰，并拿成斜角，將瓶苗莖剪成一段一芽的小莖段，然后打開接種瓶瓶蓋，用鑷子將小莖段接種到MS＋IAA 1.5mg/L繼代培養基中，蓋好蓋進行培養。側芽繼續伸長并萌發出新的側枝，4～5周后繼續分切成單芽莖段進行增殖培養。

3．觀察記錄

跟蹤觀察記錄產生愈傷組織和不定芽的時間以及出愈率、分化率和污染率等技術指標，及時淘汰劣苗、污染苗。

四、注意事項

（1）無菌操作規程。

（2）培養基滅菌。

（3）嚴守無菌操作規程。

五、考核內容與評分標準

1．相關知識

（1）瓶苗接種過程中的注意事項（30分）。

（2）瓶苗繼代方法（20分）。

2．操作技能

（1）熟練掌握瓶苗的接種（30分）。

（2）熟練掌握瓶苗的切割（10分）。

（3）熟練培養基的配制滅菌（10分）。

任務3　生根培養

一、工作目標

熟練掌握生根培養的各個技術環節，包括生根培養基的配制、生根試管的接種、培養觀察等。熟練掌握生根培養全過程。

二、材料用具

組培苗、超凈臺、剪刀、解剖刀、鑷子、培養皿、滅菌鍋、電磁爐、燒杯、培養瓶、移液管、酒精燈、無菌濾紙、75%乙醇、95%乙醇、蒸餾水、MS基本培養基各種母液、蔗糖、瓊脂、NAA激素母液等。

三、工作過程

1．生根培養基的配制

（1）吸取MS母液：按母液順序和規定量，用移液管提取母液，放入盛有一定量蒸餾水的燒杯。MS培養基無機鹽濃度較高，不適宜生根，所以一般在配制生根培養基時需要將大量元素母液減半，配制成1/2MS培養基。

（2）加入生長調節物質：生長素利于根的生長，所以一般在配制生根培養基時加入生長素。NAA即是一種比較適合的生長調節物質。

（3）加入蔗糖：30g/L。

（4）定容：按照配制的量，加蒸餾水定容后倒入鍋中。

（5）調節pH值：用0.1mol/L的NaOH或0.1mol/L的HCl調節pH值。

（6）熔化瓊脂：7g/L（視瓊脂質量而定），在電爐上加熱溶液，并不斷攪拌，使瓊脂熔化。

（7）分裝與封口：待瓊脂溶解后，馬上進行分裝與封口，防止凝固。

（8）培養基的滅菌：打開滅菌鍋鍋蓋，加水至水位線。把已裝好培養基的三角瓶，連同蒸餾水及接種用具等放入鍋筒內，裝時不要過分傾斜培養基，以免弄到瓶口上或流出。然后蓋上鍋蓋，對角旋緊螺絲，接通電源加熱，當升至0.05MPa時，打開放氣閥放氣，回“0”后關閉放氣閥。當氣壓上升到0.10MPa時，保壓滅菌20min，到時停止加熱。當氣壓回“0”后打開鍋蓋，取出培養基和滅菌用品，放于平臺上冷凝。

2．接種

（1）進入實驗室后用水和肥皂洗凈雙手，穿戴上滅過菌的專用實驗服、帽子、鞋子。

（2）打開超凈工作臺紫外燈，并打開無菌操作室內的紫外燈，照射20～30min（進行紫外滅菌）。

（3）照射20～30min后打開鼓風，關閉紫外燈，打開超凈工作臺照明燈，鼓風吹10～20min，用75%的乙醇擦拭工作臺和雙手，準備進行接種工作。

（4）用蘸有75%乙醇的紗布擦拭裝有培養基的培養瓶，放進工作臺。

（5）把接種器械浸泡在95%乙醇中，在酒精燈火焰上滅菌后，放在器械架上。

（6）用鑷子將誘導出的不定芽剝離或將組培苗取出放于培養皿內，一手用鑷子固定、一手用解剖刀將不定芽切下。用鑷子把不定芽接種到生根培養基中。注意接種時使培養基成一定的傾斜度，將不定芽的基部插入培養基的內部。每瓶接種約3個小植株。

（7）整理實驗用品。

3．培養并觀察

（1）培養：將接種完成的試管苗置于培養室，培養約20d。

（2）觀察記錄：一般12～15d后，小植株的基部即可看到有白色的根原基出現，慢慢即可變成正常的根，25d左右根長至1～3cm，當大部分根長至1～3cm時，打開瓶口，煉苗2～3d后，即可將小苗移栽到土壤中。

四、注意事項

（1）在配制培養基時，瓊脂的量稱量要準確，防止培養基不凝固。

（2）在配制培養基時，pH值要調節準確，防止培養基不凝固，或者影響培養基營養成分。

（3）接種時一定要按照無菌規范操作，減少試管苗污染。

五、考核內容與評分標準

1．相關知識

（1）記錄試管苗生根培養步驟，統計生根率（10分）。

（2）生根培養基為何使用1/2 MS培養基（10分）。

（3）具體說明接種過程中的注意事項（20分）。

2．操作技能

（1）固體培養基的配制（20分）。

（2）無菌接種（20分）。

（3）試管苗的培養與觀察（20分）。