必 備 知 識

一、培養(yǎng)基的主要成分

培養(yǎng)基的主要成分包括：水、無機成分、有機營養(yǎng)（糖類、維生素類、肌醇、氨基酸、天然有機附加物）、植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)、瓊脂等。

1．水

水是植物原生質(zhì)體的組成部分，也是一切代謝過程的介質(zhì)和溶劑，是生命活動中不可缺少的物質(zhì)，所以它在培養(yǎng)基中所占的比例是最大的。它能提供植物生長所需的C、H、O元素，在配制母液和培養(yǎng)基中，為保持母液和培養(yǎng)基配方的準確性，通常使用無菌水或蒸餾水，大規(guī)模生產(chǎn)時，也可用過濾的自來水。

2．無機成分

無機成分指植物在生長發(fā)育時所需的各種化學元素。根據(jù)植物對各種無機營養(yǎng)元素的吸收量，可將其分為大量元素和微量元素。

（1）大量元素　大量元素指培養(yǎng)基中濃度大于0.5mmol/L的元素，有N、P、K、Ca、Mg、S等。

① N　是蛋白質(zhì)、酶、葉綠素、維生素、核酸、磷脂、生物堿等的組成成分，是生命不可缺少的物質(zhì)。在制備培養(yǎng)基時N元素以NO和NH兩種形式供應。大多數(shù)培養(yǎng)基既含有NO又含有NH。NH對植物生長較為有利。作為供應物質(zhì)的有KNO₃、NH₄NO₃等。有時也添加氨基酸來補充氮素。

② P　是磷脂的主要成分。而磷脂又是原生質(zhì)、細胞核的重要組成部分。磷也是ATP、ADP等的組成成分。在植物組織培養(yǎng)過程中，向培養(yǎng)基內(nèi)添加磷，不僅能增加養(yǎng)分、提供能量，而且也促進外植體對N的吸收，增加蛋白質(zhì)在植物體中的積累。常用的物質(zhì)有KH₂PO₄或NaH₂PO₄等。

③ K　與糖類合成、轉(zhuǎn)移及氮素代謝等有密切關(guān)系。K增加時，蛋白質(zhì)合成增加，維管束、纖維組織發(fā)達，對胚的分化有促進作用。但濃度不宜過大，一般以1～3mg/L為好。制備培養(yǎng)基時，常以KCl、KNO₃等鹽類提供。

④ Mg、S和Ca　Mg是葉綠素的組成成分，又是激酶的活化劑；S是含硫氨基酸和蛋白質(zhì)的組成成分。它們常以MgSO₄·7H₂O提供，用量以1～3mg/L較為適宜。Ca是構(gòu)成細胞壁的一種成分，對細胞分裂、保護質(zhì)膜不受破壞有顯著作用，常以CaCl₂·2H₂O提供。

（2）微量元素　微量元素指培養(yǎng)基中濃度小于0.5mmol/L的元素，包括Fe、B、Mn、Cu、Mo、Co等。鐵是一些氧化酶、細胞色素氧化酶、過氧化氫酶等的組成成分。同時，它又是葉綠素形成的必要條件。培養(yǎng)基中的鐵對胚的形成、芽的分化和幼苗轉(zhuǎn)綠有促進作用。在制作培養(yǎng)基時不用Fe₂（SO₄）₃和FeCl₃[因其在pH值5.2以上，易形成Fe（OH）₃的不溶性沉淀]，而用FeSO₄·7H₂O和Na₂-EDTA結(jié)合成螯合物使用。B、Mn、Zn、Cu、Mo、Co等也是植物組織培養(yǎng)中不可缺少的元素，缺少這些物質(zhì)會導致生長、發(fā)育異常現(xiàn)象。

總之，植物必需營養(yǎng)元素可組成結(jié)構(gòu)物質(zhì)，也可是具有生理活性的物質(zhì)（如酶、輔酶及作為酶的活化劑）參與活躍的新陳代謝。此外，其還在維持離子濃度平衡、膠體穩(wěn)定、電荷平衡等電化學方面起著重要作用。當某些營養(yǎng)元素供應不足時，愈傷組織表現(xiàn)出一定的缺素癥狀。如缺氮會表現(xiàn)出一種花色素苷的顏色，不能形成導管；缺鐵則細胞停止分裂；缺硫表現(xiàn)出非常明顯的褪綠；缺錳或鉬則影響細胞的伸長。

3．有機營養(yǎng)

培養(yǎng)基中若只含有大量元素與微量元素，常稱為基本培養(yǎng)基。根據(jù)不同的培養(yǎng)目的，基本培養(yǎng)基中往往要加入一些有機物以利于快速生長。常加入的有機成分主要有以下幾類。

（1）糖類　最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是較好的碳源，可支持許多組織很好地生長。麥芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在組織培養(yǎng)中也有應用。蔗糖使用濃度在2%～3%，常用3%，即配制1L培養(yǎng)基稱取30g蔗糖，有時可用2.5%；但在胚培養(yǎng)時采用4%～15%的高濃度，因蔗糖對胚狀體的發(fā)育起重要作用。不同糖類對生長的影響不同。從各種糖對水稻根培養(yǎng)的影響來看，以葡萄糖效果最好，果糖和蔗糖相當，麥芽糖差一些。不同植物不同組織的糖類需要量也不同，實驗時要根據(jù)配方規(guī)定按量稱取，不能任意取量。高壓滅菌時一部分糖發(fā)生分解，制訂配方時要給予考慮。在大規(guī)模生產(chǎn)時，可采用食用的綿白糖代替。

（2）維生素　這類化合物在植物細胞里主要是以各種輔酶的形式參與多種代謝活動，對生長、分化等有很好的促進作用。雖然大多數(shù)的植物細胞在培養(yǎng)中都能合成所必需的維生素，但在數(shù)量上還明顯不足，通常需加入一至數(shù)種維生素，以便獲得最好的生長。主要加入的維生素有維生素B₁（鹽酸硫胺素）、維生素B₆（鹽酸吡哆醇）、維生素B₁₁（煙酸）、維生素C（抗壞血酸），有時還使用維生素H（生物素）、維生素M（葉酸）、維生素B₂（核黃素）等。一般用量為0.1～1.0mg/L。維生素B₁對愈傷組織的產(chǎn)生和活力有重要作用，維生素B₆能促進根的生長，維生素B₁₁與植物代謝和胚的發(fā)育有一定關(guān)系，維生素C有防止組織變褐的作用。

（3）肌醇　又叫環(huán)己六醇，在糖類的相互轉(zhuǎn)化中起重要作用。通常可由磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)化而成，還可進一步生成果膠物質(zhì)，用于構(gòu)建細胞壁。肌醇與六分子磷酸殘基相結(jié)合形成植酸。植酸可與鈣、鎂等陽離子結(jié)合成植酸鈣鎂，還可進一步形成磷脂，參與細胞膜的構(gòu)建。使用濃度一般為100mg/L，適當使用肌醇，能促進愈傷組織的生長以及胚狀體和芽的形成，對組織和細胞的繁殖、分化有促進作用，對細胞壁的形成也有作用。

（4）氨基酸　是很好的有機氮源，可直接被細胞吸收利用。培養(yǎng)基中最常用的氨基酸是甘氨酸，甘氨酸能促進離體根的生長。其他如精氨酸、谷氨酸、谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、絲氨酸、半胱氨酸等也常用。其中絲氨酸和谷氨酰胺有利于花藥胚狀體或不定芽的分化。半胱氨酸可作為氧化劑，有防褐變的作用。有時應用水解乳蛋白或水解酪蛋白，它們是牛乳用酶法等加工的水解產(chǎn)物，是含有約20種氨基酸的混合物，用量在10～1000mg/L。由于它們營養(yǎng)豐富，極易引起污染，如在培養(yǎng)中無特別需要，以不用為宜。

（5）天然復合物　其成分比較復雜，大多含氨基酸、激素、酶等一些復雜化合物。它對細胞和組織的增殖與分化有明顯的促進作用，但對器官的分化作用不明顯。它們的成分大多不清楚，所以一般應盡量避免使用。

① 椰乳　椰乳是椰子的液體胚乳，是使用最多、效果最好的一種天然復合物。一般使用量在10%～20%，與其果實成熟度及產(chǎn)地關(guān)系很大。它在愈傷組織和細胞培養(yǎng)中具有促進生長的作用。在馬鈴薯莖尖分生組織和草莓微莖尖培養(yǎng)中起明顯的促進作用，但莖尖組織的大小若超過1mm時，椰乳就不發(fā)生作用。

② 香蕉　一般用量為150～200mL/L。用黃熟的小香蕉，加入培養(yǎng)基后變?yōu)樽仙瑢H值的緩沖作用大，主要在蘭花的組織培養(yǎng)中應用，對發(fā)育有促進作用。

③ 馬鈴薯　馬鈴薯去掉皮和芽后，加水煮30min，再經(jīng)過過濾，取其濾液使用。用量為150～200g/L。對pH值緩沖作用也較大。添加后可得到健壯的植株。

④ 水解酪蛋白　為蛋白質(zhì)的水解物，主要成分為氨基酸，使用濃度為100～200mg/L。受酸和酶的作用易分解，使用時要注意。

⑤ 其他　酵母提取液（0.01%～0.05%），主要成分為氨基酸和維生素類；麥芽提取液（0.01%～0.5%）、蘋果和番茄的果汁、黃瓜的果實、未熟玉米的胚乳等。遇熱較穩(wěn)定，大多在培養(yǎng)困難時使用，有時有效。

4．植物激素

植物激素是植物新陳代謝中產(chǎn)生的天然化合物，它能以極微小的量影響到植物的細胞分化、分裂、發(fā)育，影響到植物的形態(tài)建成、開花、結(jié)實、成熟、脫落、衰老和休眠以及萌發(fā)等許許多多的生理生化活動，在培養(yǎng)基的各種成分中，植物激素是培養(yǎng)基的關(guān)鍵物質(zhì)，對植物組織培養(yǎng)起著決定性作用。

（1）生長素類　在組織培養(yǎng)中，生長素主要被用于誘導愈傷組織形成，誘導根的分化和促進細胞分裂、伸長生長。在促進生長方面，根對生長素最敏感。在極低的濃度下（10^－8～10^－5mg/L）就可促進生長，其次是莖和芽。天然的生長素熱穩(wěn)定性差，高溫高壓或受光條件易被破壞。在植物體內(nèi)也易受到體內(nèi)酶的分解。組織培養(yǎng)中常用人工合成的生長素類物質(zhì)。

IAA（indoleacetic acid，吲哚乙酸）是天然存在的生長素，亦可人工合成，其活力較低，是生長素中活力最弱的激素，對器官形成的副作用小，高溫高壓易被破壞，也易被細胞中的IAA分解酶降解，受光也易分解。

IBA（indolebutyric acid，吲哚丁酸）是促進發(fā)根能力較強的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)。

NAA（naphthaleneacetic acid，萘乙酸）在組織培養(yǎng)中的啟動能力要比IAA高出3～4倍，且由于可大批量人工合成，耐高溫、高壓，不易被分解破壞，所以應用較普遍。NAA和IBA廣泛用于生根，并與細胞分裂素互作促進芽的增殖和生長。

2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）啟動能力比IAA高10倍，特別在促進愈傷組織的形成上活力最高，但它強烈抑制芽的形成，影響器官的發(fā)育。適宜的用量范圍較狹窄，過量常有毒效應。

生長素配制時可先用少量95%乙醇（俗稱酒精）助溶；2，4-D可用0.1mol/L的NaOH或KOH助溶；生長素常配成1mg/mL的溶液貯于冰箱中備用。

（2）GA（gibberellic acid，赤霉素）　有20多種，生理活性及作用的種類、部位、效應等各有不同。培養(yǎng)基中添加的是GA₃，主要用于促進幼苗莖的伸長生長，促進不定胚發(fā)育成小植株；赤霉素和生長素協(xié)同作用，對形成層的分化有影響，當生長素/赤霉素比值高時有利于木質(zhì)部分化，比值低時有利于韌皮部分化；此外，赤霉素還用于打破休眠，促進種子、塊莖、鱗莖等提前萌發(fā)。一般在器官形成后，添加赤霉素可促進器官或胚狀體的生長。

赤霉素溶于乙醇，配制時可用少量95%乙醇助溶。赤霉素不耐熱，高壓滅菌后將有70%～100%失效，應當采用過濾滅菌法加入。

（3）細胞分裂素類（cytokinin）　這類激素是腺嘌呤的衍生物，包括6-BA（6-芐基氨基嘌呤）、KT（kinetin激動素）、ZT（zeatin玉米素）等。其中ZT活性最強，但非常昂貴，常用的是6-BA。

在培養(yǎng)基中添加細胞分裂素有三個作用：①誘導芽的分化促進側(cè)芽萌發(fā)生長，細胞分裂素與生長素相互作用，當組織內(nèi)細胞分裂素/生長素的比值高時，誘導愈傷組織或器官分化出不定芽；②促進細胞分裂與擴大；③抑制根的分化。因此，細胞分裂素多用于誘導不定芽的分化和莖、苗的增殖，而避免在生根培養(yǎng)時使用。

生長素與細胞分裂素的比例決定著發(fā)育的方向，是產(chǎn)生愈傷組織，還是長根或長芽。如為了促進芽器官的分化，應除去或降低生長素的濃度，或調(diào)整培養(yǎng)基中生長素與細胞分裂素的比例。

生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的使用濃度甚微，一般用“mg/L”表示。在組織培養(yǎng)中，生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的使用濃度因植物的種類、部位、時期、內(nèi)源激素等的不同而異，一般生長素的使用濃度為0.05～5mg/L，細胞分裂素為0.05～10mg/L。

5．培養(yǎng)材料的支持物

（1）瓊脂（agar）　在固體培養(yǎng)時，瓊脂是最好的固化劑。瓊脂是一種由海藻中提取的高分子糖類，本身并不提供任何營養(yǎng)。瓊脂能溶解在熱水中，成為溶膠，冷卻至40℃即凝固為固體狀凝膠。通常所說的“煮化”培養(yǎng)基，就是使瓊脂溶解于90℃以上的熱水。瓊脂的用量在6～10g/L，若濃度太高，培養(yǎng)基就會變得很硬，營養(yǎng)物質(zhì)難以擴散到培養(yǎng)的組織中去；若濃度過低，凝固性不好。新買來的瓊脂最好先試一下它的凝固力。一般瓊脂以顏色淺、透明度好、潔凈的為上品。瓊脂的凝固能力除與原料、廠家的加工方式有關(guān)外，還與高壓滅菌時的溫度、時間、pH值等因素有關(guān)。長時間的高溫會使凝固能力下降；過酸、過堿加之高溫會使瓊脂發(fā)生水解，喪失凝固能力。時間過久，瓊脂變褐，也會逐漸喪失凝固能力。

加入瓊脂的固體培養(yǎng)基與液體培養(yǎng)基相比，優(yōu)點在于操作簡便，通氣問題易于解決，便于經(jīng)常觀察研究等；但它也有不少缺點，如培養(yǎng)物與培養(yǎng)基的接觸（即吸收）面積小，各種養(yǎng)分在瓊脂中擴散較慢，影響?zhàn)B分的充分利用，同時培養(yǎng)物排出的一些代謝廢物聚集在吸收表面，對組織產(chǎn)生毒害作用。市售的各種瓊脂幾乎都含有雜質(zhì)，特別是Ca、Mg及其他微量元素。因此在研究植物組織或細胞的營養(yǎng)問題時，則應避免使用瓊脂。可在液體培養(yǎng)基表面安放一個無菌濾紙制成的濾紙橋，然后在濾紙橋上進行愈傷組織培養(yǎng)。

（2）其他　有玻璃纖維、濾紙橋、海綿等，總的要求是其排出的有害物質(zhì)對培養(yǎng)材料沒有影響或影響較小。

6．抗生物質(zhì)（antibiotic）

抗生物質(zhì)有青霉素、鏈霉素、慶大霉素等，用量在5～20mg/L。添加抗生物質(zhì)可防止菌類污染，減少培養(yǎng)中材料的損失，尤其在快速繁殖中，常因污染而丟棄成百上千瓶的培養(yǎng)物，采用適當?shù)目股乇憧晒?jié)約人力、物力和時間。尤其對大量通氣長期培養(yǎng)，效果更好。對于剛感染的組織材料，可向培養(yǎng)基中注入5%～10%的抗生素。抗生素各有其抑菌譜，要加以選擇試用，也可兩種抗生素混用。但是應當注意抗生素對植物組織的生長也有抑制作用，可能某些植物適宜用青霉素，而另一些植物卻不大適應。值得提醒的是，在工作中不能以為用了抗生素，而放松滅菌措施。此外，在停止抗生素使用后，往往污染率顯著上升，這可能是原來受抑制的菌類又滋生出來造成的。

7．抗氧化物（antioxide）

植物組織在切割時會溢泌一些酚類物質(zhì)，接觸空氣中的氧氣后，自動氧化或由酶類催化氧化為相應的醌類，產(chǎn)生可見的茶色、褐色以至黑色，這就是酚污染。這些物質(zhì)滲出細胞外就造成自身中毒，使培養(yǎng)的材料生長停頓，失去分化能力，最終變褐死亡。木本植物，尤其是熱帶木本及少數(shù)草本植物培養(yǎng)中，此現(xiàn)象較為嚴重。目前還沒有徹底解決的辦法，只能按不同的實際情況，采用添加一些藥物并適當降低培養(yǎng)溫度、及時轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上等辦法，使之有不同程度的緩解，當然嚴格選擇外植體部位、加大接種數(shù)量等也應一并考慮。抗酚類氧化常用的藥劑有半胱氨酸及維生素C，可用50～200mg/L的濃度洗滌剛切割的外植體傷口表面，或過濾滅菌后加入固體培養(yǎng)基的表層。其他抗氧化劑有二硫蘇糖醇、谷胱甘肽、硫乙醇及二乙基二硫氨基甲酸酯等。

8．活性炭（active carbon）

活性炭為木炭粉碎經(jīng)加工形成的粉末結(jié)構(gòu)，它結(jié)構(gòu)疏松、孔隙大、吸水力強，有很強的吸附作用，其顆粒大小決定著吸附能力，粒度越小、吸附能力越大。溫度低，吸附力強；溫度高，吸附力減弱，甚至解吸附。通常使用濃度為0.5～10g/L。它可以吸附非極性物質(zhì)和色素等大分子物質(zhì)，包括瓊脂所含的雜質(zhì)，培養(yǎng)物分泌的酚、醌類物質(zhì)，以及蔗糖在高壓消毒時產(chǎn)生的5-羥甲基糖醛及激素等。莖尖初代培養(yǎng)，加入適量活性炭，可以吸附外植體產(chǎn)生的致死性褐化物；其效力優(yōu)于維生素C和半胱氨酸；在新梢增殖階段，活性炭可明顯促進新梢的形成和伸長，但其作用有一個閾值，一般為0.1%～0.2%，不能超過0.2%。

活性炭對生根有明顯的促進作用，其機制一般認為與活性炭減弱光照有關(guān)，可能是由于根頂端產(chǎn)生促進根生長的IAA，但IAA遇可見光易被氧化而破壞，因此活性炭的主要作用就在于通過減弱光照保護了IAA，從而間接促進了根的生長。由于根的生長加快，吸收能力增強，反過來又促進了莖、葉的生長。此外，在培養(yǎng)基中加入0.3%活性炭，還可降低玻璃苗的產(chǎn)生頻率，對防止產(chǎn)生玻璃苗有良好的作用。

活性炭在胚胎培養(yǎng)中也有一定作用，如在葡萄胚珠培養(yǎng)時向培養(yǎng)基中加入0.1%的活性炭，可減少組織變褐和培養(yǎng)基變色，產(chǎn)生較少的愈傷組織。但是，活性炭也具有副作用，研究表示，每毫克的活性炭能吸附100mg左右的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，這說明只需要極少量的活性炭就可以完全吸附培養(yǎng)基中的調(diào)節(jié)物質(zhì)。大量的活性炭加入會削弱瓊脂的凝固能力，因此需要多加一些瓊脂。很細的活性炭也易沉淀，通常在瓊脂凝固之前，要輕輕搖動培養(yǎng)瓶。總之，那種隨意抓一撮活性炭放入培養(yǎng)基的做法，會帶來不良的后果。因此，在使用時要有量的意識，使活性炭發(fā)揮其積極作用。

9．染色劑的使用

有時為了對不同培養(yǎng)基進行標記，可在培養(yǎng)基中加入染色劑。染色劑一般用亞甲藍、中性紅、甲基紫等。使用時配制成1%的濃度，在每升培養(yǎng)基中加入1～3滴。由于染色劑的劑量極微，所以不會對實驗產(chǎn)生影響，且節(jié)省時間。

二、培養(yǎng)基的pH值

培養(yǎng)基的pH值因培養(yǎng)材料不同而異，大多數(shù)植物要求pH值為5.6～5.8，常用1mol/L的HCl和1mol/L的NaOH來調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值。

注：①經(jīng)高溫高壓滅菌后，培養(yǎng)基的pH值會下降0.2～0.8，故調(diào)整后的pH值應高于目標pH值0.5個單位；②pH值的大小影響瓊脂的凝固能力，一般pH＞6時培養(yǎng)基會變硬，pH＜5時瓊脂不能很好地凝固。

三、常用培養(yǎng)基的種類、配方及特點

1．培養(yǎng)基的種類

培養(yǎng)基有許多種類，根據(jù)不同的植物和培養(yǎng)部位及不同的培養(yǎng)目的，需選用不同的培養(yǎng)基。

最早應用培養(yǎng)基的是Sacks（1680）和Knop（1681），他們對綠色植物的成分進行了分析研究，根據(jù)植物從土壤中主要是吸收無機鹽營養(yǎng)的特性，設(shè)計出了由無機鹽組成的Sacks和Knop溶液，至今仍在作為基本的無機鹽培養(yǎng)基得到廣泛應用。以后根據(jù)不同目的進行改良產(chǎn)生了多種培養(yǎng)基，White培養(yǎng)基在20世紀40年代用得較多，現(xiàn)在還常用。而到20世紀60年代和70年代則大多采用MS等高濃度培養(yǎng)基，它可以保證培養(yǎng)材料對營養(yǎng)的需要，并且生長快、分化快，而且由于濃度高，在配制、消毒過程中某些成分含量有些出入，也不致影響培養(yǎng)基的離子平衡。

培養(yǎng)基的名稱一直根據(jù)沿用的習慣，多數(shù)以發(fā)明人的名字來命名，如White培養(yǎng)基，Murashige和Skoog培養(yǎng)基（簡稱MS培養(yǎng)基），也有對某些成分進行改良稱作改良培養(yǎng)基。

（1）根據(jù)態(tài)相不同固體培養(yǎng)基

（2）根據(jù)培養(yǎng)物的培養(yǎng)過程初代培養(yǎng)基

（3）根據(jù)作用不同

（4）根據(jù)營養(yǎng)水平不同

2．幾種常用培養(yǎng)基的特點

目前國際上流行的培養(yǎng)基有幾十種，常用的培養(yǎng)基及特點如下。

（1）MS培養(yǎng)基　MS培養(yǎng)基是1962年由Murashige和Skoog為培養(yǎng)煙草細胞而設(shè)計的。特點是無機鹽和離子濃度較高，為較穩(wěn)定的平衡溶液。其養(yǎng)分的數(shù)量和比例較合適，可滿足植物的營養(yǎng)和生理需要。它的硝酸鹽含量較其他培養(yǎng)基為高，廣泛用于植物的器官、花藥、細胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)，效果良好。有些培養(yǎng)基是由它演變而來的。

（2）White培養(yǎng)基　White培養(yǎng)基是1943年由White為培養(yǎng)番茄根尖而設(shè)計的。1963年又做了改良，提高了MgSO₄的濃度和增加了硼素，稱作White改良培養(yǎng)基。其特點是無機鹽數(shù)量較低，適于生根培養(yǎng)。

（3）N₆培養(yǎng)基　N₆培養(yǎng)基是1974年朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培養(yǎng)而設(shè)計的。其特點是成分較簡單，KNO₃和（NH₄）₂SO₄含量高。在國內(nèi)已廣泛應用于小麥、水稻及其他植物的花藥培養(yǎng)和其他組織培養(yǎng)。

（4）B₅培養(yǎng)基　B₅培養(yǎng)基是1968年由Gamborg等為培養(yǎng)大豆根細胞而設(shè)計的。其主要特點是含有較低的銨，這可能對不少培養(yǎng)物的生長有抑制作用。從實踐得知，有些植物在B₅培養(yǎng)基上生長更適宜，如雙子葉植物特別是木本植物。

（5）KM-8P培養(yǎng)基　KM-8P培養(yǎng)基是1974年為原生質(zhì)體培養(yǎng)而設(shè)計的。其特點是有機成分較復雜，它包括了所有的單糖和維生素，廣泛用于原生質(zhì)融合的培養(yǎng)。

3．幾種常用培養(yǎng)基的配方

幾種常用培養(yǎng)基的配方見表2-1。

四、培養(yǎng)基配方試驗設(shè)計與篩選

在進行植物組織培養(yǎng)時，選擇最佳培養(yǎng)基是成功的關(guān)鍵。為了能研制出一種適用的培養(yǎng)基，最好先選用一種已被廣泛采用的基本培養(yǎng)基（如MS、B₅、White、H等）。當通過一系列的實驗，對該種基本培養(yǎng)基做了某些定性和定量的小變動之后，即有可能得到一種能滿足實驗需要的新培養(yǎng)基。在改動培養(yǎng)基的時候，無機成分和有機成分應當分別處理。

在植物組培快繁中，最常改動的因子是生長調(diào)節(jié)物質(zhì)（植物激素），尤其是生長素和細胞分裂素。

例如，進行不定芽的誘導培養(yǎng)時，開始可選用一種基本培養(yǎng)基（如MS），再附加細胞分裂素類（如6-BA）、生長素類（如IBA）；細胞分裂素和生長素分別設(shè)定不同的濃度，如6-BA、IBA各設(shè)5種不同濃度 （見表2-2），這兩種激素5種濃度的所有可能組合，即構(gòu)成了一個具有25項處理的實驗。由這25項處理中選出最佳的一個組合，然后在保持濃度不變的情況下，再試驗其他種類的生長素和細胞分裂素。當改變細胞分裂素的種類時，保持原生長素不變，反之亦然。另外，雖然高濃度鹽分培養(yǎng)基對若干實驗體系來說都已證明效果很好，但有些培養(yǎng)物在低濃度鹽分培養(yǎng)基上生長得會更好。因此，在保持生長調(diào)節(jié)物質(zhì)最佳組合不變的情況下，就還有必要試驗一下1/4和1/2水平的基本培養(yǎng)基鹽分的效果。最后，還要進行一系列的實驗以確定最適合的蔗糖濃度（2%～6%以至更高）。通過上述這些實驗，常常就足以研制出一種適合的培養(yǎng)基。不過，要對這種培養(yǎng)基做進一步的改良，還有很多其他可能性值得探討。

為了能為一個新的實驗體系選出最適合的培養(yǎng)基，De Fossard等（1974）介紹了“廣譜實驗法”。與上面介紹的方法相比，這一方法比較復雜。但若利用簡單的方法解決不了問題，就有必要用該方法試驗一下。

這種廣譜實驗法是把培養(yǎng)基中的所有組分分為4大類，即無機鹽、生長素、細胞分裂素、有機營養(yǎng)物質(zhì)（蔗糖、氨基酸和肌醇等）。對每一類物質(zhì)再選定低（L）、中（M）、高（H）3種濃度（見表2-3），4類物質(zhì)各3種濃度的不同組合構(gòu)成一項包括81個處理的實驗。在這81個處理中，篩選出適宜的處理。達到這個階段以后，即可再試驗不同類型的生長素和細胞分裂素，以篩選出它們的最佳類型。有些實驗系統(tǒng)對于生長素和細胞分裂素這兩類生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的具體形式非常敏感。

在植物組織培養(yǎng)中，影響因素較多，如基本培養(yǎng)基、細胞分裂素、生長素、糖濃度、光照、pH值等。要篩選出最佳培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，需要進行大量的實驗。為了減少實驗次數(shù)，節(jié)約時間，常采用正交實驗設(shè)計。

正交設(shè)計是多因素分析的有力工具，它可以很方便地從眾多因素中選出主要影響因素及最佳水平，因其可以用較少的實驗次數(shù)得到較多的信息。如7因素2水平的實驗，要將各因素水平全部組合都做一次，需要做128次實驗，而正交設(shè)計只需做8次實驗就基本代表了全部實驗情況，可收到事半功倍的效果。正交設(shè)計的主要工具是正交表，在進行組培快繁多因素分析時，可參照生物統(tǒng)計學有關(guān)章節(jié)，選擇與實驗相符合的正交表，然后進行實驗和分析。

五、培養(yǎng)基的配制和保存

1．母液的配制和保存

在植物組織培養(yǎng)工作中，配制培養(yǎng)基是日常必備的工作。為簡便起見，通常先配制一系列母液，即貯備液。所謂母液是欲配制營養(yǎng)液的濃縮液，這樣做不但可以保證各物質(zhì)成分配制時的準確性及快速移取，而且還便于低溫保藏。一般母液濃度為所需濃度的10～100倍。母液配制時可分別配成大量元素、微量元素、鐵鹽、有機物和激素類等。配制時注意一些離子之間易發(fā)生沉淀，如Ca^2＋和SO，Ca^2＋、Mg^2＋和PO一起溶解后，會產(chǎn)生沉淀，一定要充分溶解再放入母液中。配制母液時要用蒸餾水或重蒸餾水。藥品應選取等級較高的化學純或分析純。藥品的稱量及定容都要準確。各種藥品先以少量水讓其充分溶解，然后依次混合。一般配成大量元素、微量元素、鐵鹽、維生素等母液，其中維生素、氨基酸類可以分別配制，也可以混在一起。母液配好后放入冰箱內(nèi)低溫保存，用時再按比例稀釋。

下面以MS培養(yǎng)基制備為例，概述其制備方法（配方見表2-4，具體制備方法見任務(wù)1）。

（1）大量元素母液　可配成為所需濃度10倍的母液。用分析天平按表2-4稱取藥品，分別加100mL左右蒸餾水溶解后，再用磁力攪拌器攪拌，促進溶解。注意Ca^2＋和PO易發(fā)生沉淀。然后倒入1000mL定容瓶中，再加水定容至刻度，成為10倍母液。

（2）微量元素母液　可配成為所需濃度100倍的母液。用分析天平按表2-2準確稱取藥品后，分別溶解，混合后加水定容至1000mL。

（3）鐵鹽母液　可配成100倍的母液，按表2-4稱取藥品，可加熱溶解，混合后加水定容至1000mL。

（4）有機物母液　可配成500倍的母液。按表2-4分別稱取藥品，溶解，混合后加水定容至500mL。

（5）激素母液的配制　每種激素必須單獨配成母液，濃度一般為1mg/mL。用時根據(jù)需要取用。因為激素用量較少，一次可配成50mL或100mL。另外，多數(shù)激素難溶于水，要先溶于可溶物質(zhì)，然后才能加水定容。

它們的配法如下。將IAA、IBA、GA等先溶于少量的95%乙醇溶液中，再加水定容。NAA可先溶于熱水或少量95%乙醇溶液中，再加水定容。2，4-D可用少量1mol/L NaOH溶解后，再加水定容。KT和BA先溶于少量1mol/L的HCl中再加水定容。將玉米素先溶于少量95%的乙醇中，再加熱水定容。配制好的母液瓶上應分別貼上標簽，注明母液名稱、配制倍數(shù)、日期及配1L培養(yǎng)基時應取的量。

2．培養(yǎng)基的制備

以配制1L MS培養(yǎng)基為例，簡要介紹培養(yǎng)基的配制過程。

（1）在燒杯中放入一定量的水，再按母液的順序依次加入需要的量。

（2）加入蔗糖并溶解。

（3）定容至所要求的體積。

（4）調(diào)節(jié)pH值，可用pH試紙或酸度計進行測量。

在用酸度計測量前，首先要對其進行校準，常用的校正液有三種：鄰苯二甲酸氫鉀（pH4.00，25℃）、混合磷酸鹽（pH6.86，25℃）、四硼酸鈉（pH9.18，25℃），選擇合適的校正液進行校準，校準后才可測定pH值。

（5）加入瓊脂，并加熱溶解，溶解過程中攪拌，以免造成濃度不均勻。

（6）培養(yǎng)基分裝。將配好的培養(yǎng)基在其未凝固的情況下（40℃）盡快分裝到試管、三角瓶等培養(yǎng)容器中，分裝時要掌握好培養(yǎng)基的量，一般以占試管、三角瓶等培養(yǎng)容器的1/4～1/3為宜，分裝時要注意不要將培養(yǎng)基沾到壁口，以免引起污染。

（7）封口：分裝后的培養(yǎng)基應盡快封口，以免培養(yǎng)基中的水分蒸發(fā)。

（8）滅菌：封口后的培養(yǎng)基應盡快進行高壓蒸汽滅菌，滅菌不及時會造成雜菌大量繁殖，使培養(yǎng)基失去效用。

滅菌過程中應注意：滅菌前應檢查一下滅菌鍋底部的水是否充足，應添加到水位線處；滅菌加熱過程中應使滅菌鍋內(nèi)的冷空氣排盡，以保證滅菌徹底。

排氣的方法有兩種：一種是開始時就打開放氣閥，等大量冷空氣排出后再關(guān)閉放氣閥；另一種是先關(guān)閉放氣閥，當壓力升到0.05MPa時，打開放氣閥排出冷空氣后，再關(guān)閉放氣閥進行升溫、升壓。

滅菌時，應使壓力表讀數(shù)為0.1～0.15MPa即121℃保持20min即可，滅菌時間不宜過長，否則蔗糖等有機物會在高溫下分解，使培養(yǎng)基變質(zhì)，甚至難以凝固，滅菌時間也不宜過短，否則滅菌不徹底易造成培養(yǎng)基污染。

滅菌后應切斷電源，使滅菌鍋內(nèi)的壓力緩慢降下來，接近“0”時，才可打開放氣閥，排出剩余蒸汽后，打開鍋蓋取出培養(yǎng)基。（若切斷電源后急于取出培養(yǎng)基而打開放氣閥，造成降壓太快，使容器內(nèi)外壓強差過大，會使液體溢出造成浪費、污染，甚至危害人身安全。）

某些生長調(diào)節(jié)物質(zhì)（如IAA、IBA、ZT及某些維生素、抗生素、酶類等）濕熱易分解，不能進行高壓、高溫滅菌，需要進行過濾滅菌。

3．培養(yǎng)基的存放

經(jīng)過高溫高壓滅菌的培養(yǎng)基取出后，放在潔凈、無灰塵、遮光的環(huán)境中進行貯存。貯存的時間不宜過長，盡可能在兩周內(nèi)用完。含有生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的培養(yǎng)基最好能在4℃低溫保存，效果更理想（注意在培養(yǎng)基凝固過程中不要移動容器，待凝固后再進行轉(zhuǎn)移。）