1.4　熒光光譜

分子發(fā)光分析主要包括分子熒光分析、分子磷光分析和化學發(fā)光分析。分子由基態(tài)激發(fā)至激發(fā)態(tài)，所需激發(fā)能可由光能、化學能或電能等供給。若分子吸收了光能而被激發(fā)到較高能態(tài)，在返回基態(tài)時，發(fā)射出與吸收光波長相等或不等的輻射，這種現(xiàn)象稱為光致發(fā)光。熒光分析和磷光分析就是基于這類光致發(fā)光現(xiàn)象建立起來的分析方法。物質的基態(tài)分子受一激發(fā)光源的照射，被激發(fā)至激發(fā)態(tài)后，在返回基態(tài)時，產(chǎn)生波長與入射光相同或較長的熒光，通過測定物質分子產(chǎn)生的熒光強度進行分析的方法稱為分子熒光分析。若在化學反應中，產(chǎn)物分子吸收了反應過程中釋放的化學能而被激發(fā)，在返回基態(tài)時發(fā)出光輻射稱為化學發(fā)光或生物發(fā)光。根據(jù)化學發(fā)光強度或化學反應產(chǎn)生的總發(fā)光強度來確定物質含量的方法稱為化學發(fā)光分析法。

分子熒光分析可應用于物質的定性及定量分析。由于物質結構不同，分子所能吸收的紫外光波長不同，在返回基態(tài)時，所發(fā)射的熒光波長也不同，利用這個性質可以對物質進行定性分析；對于兩種物質的稀溶液，其產(chǎn)生的熒光強度與濃度呈線性關系，利用這個性質可進行定量分析。熒光分析法的主要特點是：①靈敏度高，檢出限為10-7～10-9g·mL-1，比紫外-可見分光光度法高10～103倍；②選擇性強，能吸收光的物質并不一定產(chǎn)生熒光，且不同物質由于結構不同，雖吸收同一波長的光，產(chǎn)生的熒光波長卻不同；③用樣量少、操作簡便。熒光分析法的缺點是，由于許多物質不發(fā)射熒光，因此使它的應用范圍受到限制。

目前，分子熒光分析應用日益增多，在高分子材料分析、分子生物學、免疫學、生物醫(yī)學、環(huán)境監(jiān)測、食品分析及農(nóng)牧產(chǎn)品分析等方面應用日益廣泛，本章主要介紹熒光光譜基本原理和方法及其在高分子材料分析中的應用。

1.4.1　熒光光譜基本原理與方法

熒光和磷光同屬于發(fā)光光譜，反映了分子在吸收輻射能被激發(fā)到較高電子能態(tài)后，為了返回基態(tài)而釋放出能量。熒光是分子在吸收輻射之后立即（在10-8s數(shù)量級）發(fā)射的光，而磷光則是在吸收能量后延遲釋放的光。兩者的區(qū)別是：熒光是由單態(tài)—單態(tài)的躍遷產(chǎn)生的，而磷光所涉及的是三重態(tài)—單態(tài)躍遷。

熒光光譜（molecular luminescence analysis）通過激發(fā)光譜和發(fā)射光譜提供包括熒光強度、量子產(chǎn)率、熒光壽命、熒光偏振等多個物理參數(shù)，具有靈敏度高、選擇性強、用樣量少、方法簡便等優(yōu)點。尤其是熒光探針（probe）或標記（label）的引入極大地擴展了熒光光譜在高聚物研究中的應用。目前，熒光光譜已經(jīng)深入到高聚物科學的各個領域，它能提供分子水平的信息，在高聚物構象、形態(tài)、動態(tài)以及共混相容性等方面的研究已取得顯著的成功。

1.4.1.1　熒光光譜的基本原理

熒光光譜與紫外光譜一樣都是電子光譜，不同的是前者為電子發(fā)射光譜，后者為電子吸收光譜。樣品受到光源發(fā)出的光照射，其分子和原子中的電子由基態(tài)激發(fā)到激發(fā)態(tài)。激發(fā)態(tài)有兩種電子態(tài)：一種為激發(fā)單線態(tài)，處于這種狀態(tài)的兩個電子的自旋是配對的（反相平行），自旋量子數(shù)的代數(shù)和s=0，保持單一量子態(tài)，即2s+1=1；第二種為激發(fā)三線態(tài)，處于這種狀態(tài)的兩個電子的自旋不配對（同相平行），自旋量子數(shù)的代數(shù)和s=1，在激發(fā)時分裂為3個量子態(tài)，即2s+1=3。

一般對分析上有用的熒光體系幾乎都是含有一個或幾個苯環(huán)的復雜有機化合物。這些化合物中能產(chǎn)生最強熒光的吸收過程通常是π→π*躍遷。

（1）分子的激發(fā)態(tài)

大多數(shù)分子含有偶數(shù)個電子，在基態(tài)，這些自旋成對的電子在各個原子或分子軌道上運動，方向相反。電子的自旋狀態(tài)可以用自旋量子數(shù)（ms）表示，ms=±1/2。所以配對電子自旋總和是零。如果是一個分子所有的電子自旋是成對的，那么這個分子光譜項的多重性M=2s+1=1，此時，所處的電子能態(tài)稱單重態(tài)，以s0表示。當配對電子中一個電子被激發(fā)到某一較高能級時，將可能形成兩種激發(fā)態(tài)，一種是受激電子的自旋仍然與處于基態(tài)的電子配對（自旋相反），則該分子處子激發(fā)單重態(tài)，以s表示； 另一種是受激電子的白族與處于基態(tài)的電子不再配對，而是相互平行，s=1，2s+1=3，則分子是處于激發(fā)三重態(tài)，以T表示。

激發(fā)單重態(tài)與激發(fā)三重態(tài)的性質有明顯不同。其主要不同點是：①激發(fā)單重態(tài)分子是抗磁性分子，而激發(fā)三重態(tài)分子則是順磁性的；②激發(fā)單重態(tài)的平均壽命約為10-8s，而激發(fā)三重態(tài)的平均壽命長達10-4～1s；③基態(tài)單重態(tài)到激發(fā)單重態(tài)的激發(fā)容易發(fā)生，為允許躍遷，而基態(tài)單重態(tài)到激發(fā)三重態(tài)的激發(fā)概率只相當于前者的10-6，實際上屬于禁阻躍遷；④激發(fā)三重態(tài)的能量較激發(fā)單重態(tài)的能量低。

（2）分子的去活化過程

分子中處于激發(fā)態(tài)的電子以輻射躍遷方式或無輻射躍遷方式最終回到基態(tài)，這一過程中，各種不同的能量傳遞過程統(tǒng)稱為去活化過程。輻射躍遷主要是熒光和磷光的發(fā)射；無輻射躍遷是指分子以熱的形式失去多余能量，包括振動弛豫、內(nèi)轉換、系間跨越、淬滅等。各種躍遷方式發(fā)生的可能性及程度與熒光物質分子結構和環(huán)境等因素有關。

當處于基態(tài)單重態(tài)（s0）的分子吸收波長為λ1和λ2的輻射后，分別被激發(fā)至第一激發(fā)單重態(tài)（s1）和第二激發(fā)單重態(tài)（s2）的任一振動能級上，而后發(fā)生下述失活過程。

① 振動弛豫　同一電子能級內(nèi)以熱能量交換形式由高振動能級至低振動能級間的躍遷，這一過程屬無輻射躍遷，稱為振動弛豫。發(fā)生振動弛豫的時間為10-13～10-11s。

② 內(nèi)轉換　相同多重態(tài)電子能級中，等能級間的無輻射能級交換稱為內(nèi)轉換。如第二激發(fā)單重態(tài)的某一較低振動能級，與第一激發(fā)單重態(tài)的較高振動能級間有重疊時，位能相同，可能發(fā)生電子由高電子能級以無輻射躍遷的方式躍遷至低能級上。此過程效率高，速度快，一般只需10-13～10-11s。通過內(nèi)轉換和振動弛豫，較高能級的電子均躍回到第一電子激發(fā)態(tài)（s1）的最低振動能級（ν=0）上。

③ 系間跨越　指激發(fā)單重態(tài)與激發(fā)三重態(tài)之間的無輻射躍遷。此時，激發(fā)態(tài)電子自旋反轉，分子的多重性發(fā)生變化。如單重態(tài)（s1）的較低振動能級與三重態(tài)t1的較高振動能級有重疊，電子有可能發(fā)生自旋狀態(tài)的改變而發(fā)生系間跨越。含有重原子（如碘、溴等）的分子中，系間跨越最為常見，這是由于高原子序數(shù)的原子中電子自旋與軌道運動之間相互作用較強，更有利于電子自旋發(fā)生改變的緣效。

④ 熒光發(fā)射　處于激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級的分子，也存在幾種可能的去活化過程。若以10-9～10-7s的時間發(fā)射光量子回到基態(tài)的各振動能級，這一過程就有熒光發(fā)生，稱為熒光發(fā)射。

⑤ 磷光發(fā)射　分子一旦發(fā)生系間跨越躍遷后，接著就會發(fā)生快速的振動弛豫而達到三重激發(fā)態(tài)t1的最低振動能級（ν=0）上，再經(jīng)輻射躍遷到基態(tài)的各振動能級就能發(fā)射磷光，這一過程稱為磷光發(fā)射。這種躍遷，在光照停止后，仍可持續(xù)一段時間，因此磷光比熒光的壽命長。通過熱激發(fā)，可能發(fā)生t1→s1的系間跨越，然后由s1發(fā)射熒光，這種熒光稱延遲熒光。第一電子激發(fā)態(tài)三重態(tài)與單重態(tài)之間能量差較小，隨振動耦合增加而增加內(nèi)轉換的概率，從而使磷光減弱或消失。另外，由于激發(fā)三重態(tài)的壽命較長，增大了分子與溶劑分子間碰撞而失去激發(fā)能的可能性，因此室溫下不易觀察到磷光現(xiàn)象。

⑥ 淬滅　激發(fā)分子與溶劑分子或其他溶質分子間相互作用，發(fā)生能量轉移，使熒光或磷光強度減弱甚至消失，這一現(xiàn)象稱為“淬滅”。

總之，激發(fā)態(tài)分子的去活化過程可歸納如下所示：

由于不同物質的分子結構及分析時所處的環(huán)境不同，因此各個去活化過程的速率也就不同。如果熒光發(fā)射過程比其他去活化過程速率更快。就可觀察到熒光現(xiàn)象。相反，如果無輻射躍遷過程具有更大的速率常數(shù)，熒光將消失或強度減弱。

1.4.1.2　高聚物熒光光譜的研究方法

高聚物熒光光譜研究從方法上可分為直接測定法和間接測定法兩種。直接測定法是利用高聚物自身發(fā)射的熒光進行分析的方法，又稱為“自熒光”或“內(nèi)源熒光”方法。間接測定法是引入熒光探針[即“探針”（probe）或“標記”（label）化合物]，在分子水平上研究某些體系的物理、化學過程以及檢測某些特殊環(huán)境下材料的結構和物理性質的方法。所謂“探針”是將含生色團小分子用物理方法分散在高分子體系中，而“標記”則是指生色團以化學鍵連接在高分子鏈上。按不同研究目的，“標記”基團可以連接在鏈內(nèi)或鍵端，同一分子鏈上可以含一種或兩種不同的生色團。

間接測定法的基本特點是具有高靈敏度和極寬的動態(tài)時間響應范圍，可用于體系穩(wěn)態(tài)性質的研究和動態(tài)過程的監(jiān)測。該方法所需探針試劑濃度極稀，僅10-9mol·L-1的濃度就能滿足檢測要求，對研究那些要求盡量減少外來分子影響的體系非常重要。值得注意的是，所選擇的探針必須與被研究高聚物的某一微區(qū)具有特異性的結合，并且結合得比較牢固，同時探針試劑的熒光要對環(huán)境條件敏感，但又不能影響被研究高聚物的結構和特性。

間接測定法中引入的探針在高聚物體系中的旋轉弛豫對高聚物的分子質量不敏感，只與其自由體積相關。不同類型的探針在激發(fā)后的構象變化所涉及的體積大小不同，可以反映出不同體積分數(shù)，因此可利用這一特點估測體系中不同自由體積的分布。按照弛豫機制的不同，探針至少可分為5種類型：①具有分子內(nèi)電荷轉移態(tài)的給體-受體分子探針（TICT）；②可形成激基締合物的探針（Excimer）；③預扭曲TICT型探針；④異構體類Dewar型探針；⑤二苯乙烯類化合物的順反異構化探針。不同類型的探針具有不同的檢測極限，激基締合物的形成和順反異構化的變化能測得高聚物中較大的自由體積，而預扭曲的TICT型及Dewar型探針則測定體系中較小的自由體積，TICT型探針的檢測范圍介于兩者之間。

1.4.2　分子熒光光譜儀

1.4.2.1　熒光光譜分析儀基本結構流程

熒光分析通常用熒光分光光度計，與其他光譜分析儀器一樣，主要有光源（激發(fā)光源）、樣品池、單色器系統(tǒng)及檢測器四部分組成。不同的是熒光分析儀器需要兩個獨立的波長選擇系統(tǒng)，一個為激發(fā)單色器，可對光源進行分光，選擇激發(fā)波長；另一個用來選擇發(fā)射波長，或掃描測定各發(fā)射波長下的熒光強度，可獲得試樣的發(fā)光光譜。檢測器與激發(fā)光源成直角。熒光分析儀器的基本結構流程如圖1-42所示。

（1）激發(fā)光源　激發(fā)光源應具有強度大，穩(wěn)定性好、適用波長范圍寬等特點。因為光源的強度直接影響測定的靈敏度，而光源的穩(wěn)定性直接影響到測定的重復性和精確度。常用的光源有高壓汞燈氙燈和鹵鎢燈。高壓汞燈常用在熒光計中，發(fā)射光強度大而穩(wěn)定。熒光分析中常用365nm、405nm、436nm三條譜線但不是連續(xù)光譜。分光熒光計所用的光源大都采用150W和500W的高壓氙燈作為光源，發(fā)射強度大能在紫外-可見光區(qū)給出比較好的連續(xù)光譜可用于200～700nm波長范圍，在200～400nm波段內(nèi)輻射線強度幾乎相等。單氙燈需要穩(wěn)定光源以保證光源的穩(wěn)定。

（2）單色器　熒光分光光度計有兩個單色器——激發(fā)單色器和發(fā)射單色器。激發(fā)單色器放于光源和樣品池之間起作用是讓所選擇的激發(fā)光透過并照射于被測試樣上。放于試樣和檢測器之間的為發(fā)射單色器，它的作用是把激發(fā)光所發(fā)生在容器表面的雜散光濾去，讓熒光物質發(fā)出的熒光通過且照射到檢測器上。

熒光計用濾光片作單色器，分激發(fā)濾光片和熒光濾光片。它們的功能比較簡單，價格也便宜，適用于固定試樣的常規(guī)分析。大部分分光熒光計采用光柵作為單色器。在測定激發(fā)光譜時，應固定發(fā)射單色器波長，而掃描激發(fā)單色器波長；而當測定熒光物質的熒光光譜時，則應固定激發(fā)單色器波長，掃描發(fā)射單色器的波長。

（3）狹縫　在儀器上狹縫是用來調節(jié)一定的光通量和單色性的裝置。狹縫越小單色性越好，但光強和靈敏度降低。因此通常狹縫應調節(jié)到既有足夠大的光通量，同時也有較好的分辨率為宜。

（4）樣品池　熒光分析用的樣品池需用低熒光材料，常用石英池。有的熒光分光光度計附有恒溫裝置。測定低溫熒光時，在石英池外套上一個盛有液氮的石英真空瓶，以便降低溫度。

（5）檢測器　熒光的強度比較弱，因此要求檢測器有較高的靈敏度。在熒光計中常用光電池或光電管；在一般較精密的分光熒光光度計中常用光電倍增管檢測。為了改善信噪比，常采用冷卻檢測器的辦法。二極管陣列和電荷轉移檢測器的使用，更大程度上提高了儀器測定的靈敏度，并可以快速記錄激發(fā)和發(fā)射光譜，還可以記錄三維熒光光譜圖。

熒光光譜儀與紫外光譜儀、紅外光譜儀的不同之處主要有兩點：一是它有兩個單色器，在樣品池前設一激發(fā)單色器，光經(jīng)激發(fā)單色器濾光后照射樣品池，樣品產(chǎn)生的熒光經(jīng)過第二個單色器-發(fā)射單色器后進入檢測器；二是為了避免激發(fā)單色器的輻射光被檢測，在垂直于入射光的方向測定熒光或磷光的相對強度。進行磷光測定時，在樣品室內(nèi)必須裝有帶石英窗的特殊杜瓦瓶和石英試樣管。 如果在熒光計的樣品池前后的光路中分別加偏振器和檢偏器，還可以測量偏振熒光。熒光光譜儀的光源一般用氙燈或高壓汞燈。而有些文獻中介紹的X熒光光譜儀則是用X射線或放射性同位素輻射源照射樣品，將其原子中的某內(nèi)層電子轟擊出來成為自由電子，并在內(nèi)層形成電子空穴。當其他內(nèi)層電子發(fā)生層間竄躍進入空穴時發(fā)生輻射，產(chǎn)生熒光X射線。有這種熒光X射線的波長和強度可以獲得元素的種類和含量等信息。這兩種熒光分析方法的原理和研究內(nèi)容是不同的，應加以區(qū)別。

先進的熒光光譜儀既能測定液體樣品又能測定固體樣品。聚合物的研究多用溶液體系，溶液的濃度一般為10-5～10-4mol·L-1，用石英液槽進行測定。測定液體樣品時，要慎重選擇溶劑：一是要選擇非極性或極性很小的溶劑；二是要求溶劑本身的吸光度小；三是要保證溶劑的純度。無機發(fā)光材料的研究一般用固體樣品，可將樣品壓成片狀，放在小托盤中，樣品平面與入射角成45°放置。

1.4.2.2　熒光強度與熒光量子產(chǎn)率

并不是任何物質都能發(fā)射熒光，能產(chǎn)生熒光的分子稱為熒光分子。分子結構與熒光的發(fā)生及熒光強度的大小緊密相關。

稀溶液中的熒光強度I可出式（1-23）計算：

I=ΦFK'AI0　　（1-23）

式中，ΦF為熒光量子產(chǎn)率，代表處在電子激發(fā)態(tài)的分子放出熒光的概率；K'為檢測效率，是與熒光儀結構有關的參數(shù)，并與樣品和聚光鏡之間的距離、檢測器的靈敏度有關；A為吸光度；I0為入射光的強度。

分子產(chǎn)生熒光必須具備兩個條件：①具有合適的結構。熒光分子通常為含有苯環(huán)或稠環(huán)的剛性結構有機分子，如典型的熒光物質熒光素的分子結構；②具有一定的熒光量子產(chǎn)率。由熒光產(chǎn)生過程可知，物質分子在吸收了特征頻率的輻射能之后，必須具有較高的熒光效率，用ΦF表示，常稱為熒光量子產(chǎn)率。

熒光量子產(chǎn)率的定義為：

ΦF=　　（1-24）

在產(chǎn)生熒光的過程中，涉及許多輻射和無輻射躍遷過程。很明顯，熒光效率將與上述每個過程的速率常數(shù)有關。若用數(shù)學式表示，得到

ΦF=　　（1-25）

式中，kF為熒光發(fā)射過程的速率常數(shù)，主要取決于物質的化學結構；∑ki為其他有關過程的速率常數(shù)的總和，主要取決于產(chǎn)生熒光的化學環(huán)境，同時也與物質的化學結構有關。顯然，凡是能使kF值升高并使物質ki值降低的因素，都可增強熒光。高熒光物質如熒光素，其ΦF值在某些情況下接近于1，說明∑ki很小，可以忽略不計。多數(shù)物質的ΦF值一般都小于1，如羅丹明B的乙醇溶液ΦF=0.97；蒽的乙醇溶液ΦF=0.30。熒光效率大，在相同濃度下，熒光發(fā)射的強度IF也大。當ΦF=0時，就意味著不能發(fā)射熒光。

熒光量子產(chǎn)率是一個物質熒光特性的重要參數(shù)，它反映了熒光物質發(fā)射熒光的能力，其值越大物質發(fā)射的熒光越強。

1.4.2.3　熒光譜圖

一臺熒光光譜儀可對任何一種熒光試樣提供兩種熒光譜圖：熒光激發(fā)光譜（excitation spectrum）和熒光發(fā)射光譜（emission spectrum）。熒光激發(fā)光譜是固定發(fā)射單色器的波長λem及狹縫寬度，使激發(fā)單色器的波長連續(xù)變化，從而得到熒光激發(fā)掃描譜圖，其縱坐標為相對熒光強度，橫坐標為激發(fā)光的波長。熒光發(fā)射光譜通常稱為熒光光譜，它是固定激發(fā)單色器的波長λex及狹縫寬度，使發(fā)射單色器的波長連續(xù)變化，從而得到熒光發(fā)射掃描譜圖，其縱坐標為相對熒光強度，橫坐標為發(fā)射光的波長。熒光光譜與紫外-可見光譜在聚合物的分析中往往同時使用，相互印證。其中，熒光激發(fā)單色器波長λex的固定數(shù)值可通過測定樣品的紫外-可見光譜的最大吸收所對應的波長值來確定；熒光發(fā)射單色器波長λem的固定數(shù)值可通過熒光發(fā)射光譜的最大強度所對應的波長值來確定。

圖1-43 給出了蒽的甲醇溶液（0.3μg·ml-1）測得的發(fā)射和激發(fā)光譜。其中，曲線A是從350～500nm的發(fā)射光譜；曲線B是激發(fā)光譜，波長從220～390nm。激發(fā)光譜中每一譜帶的波長位置與紫外-可見吸收光譜中譜帶的位置是一樣的。從圖中還可以看出，蒽的發(fā)射光譜與激發(fā)光譜互為映像。

1.4.2.4　熒光與分子結構的關系

（1）躍遷類型　實驗證明，對于大多數(shù)熒光物質分子來說，存在π*→π和π*→n躍遷的熒光效率高，系間跨越過程的速率常數(shù)較小，有利于熒光的產(chǎn)生。在這兩種躍遷類型中，π*→π躍遷常能發(fā)出較強的熒光（較大的熒光效率），這主要是由于π→π*躍遷具有較大的摩爾吸光系數(shù)（一般比n→π*躍遷大102～103倍）。

（2）共軛效應　提高π電子共軛程度的結構，有利于增加熒光效率并產(chǎn)生紅移。如對苯基化、間苯基化和乙烯基化的作用會增加光的強度，并使熒光光譜紅移，見表1-11。含有脂肪族和脂環(huán)族碳基結構或高共軛雙鍵結構的化合物也可能發(fā)生熒光，如含有高共軛雙鍵的脂肪烴維生素A也有熒光，但這一類化合物數(shù)目要比芳香類化合物少。

（3）剛性平面結構　分子具有剛性的不飽和的平面結構可降低分子振動，減少與溶劑的相互作用，故具有較高的熒光效率。分子剛性及共平面性越大，熒光效率越高，并使熒光波長紅移。例如酚酞和熒光素有相似結構，但熒光素中多1個氧橋，使其具有剛性平面結構，因而熒光素有強烈熒光，而酚酞的熒光卻很弱。某些螯合劑本身不發(fā)生熒光或熒光較弱，但與金屬離子螯合后，平面構型和剛性增強，就可發(fā)生或增強熒光。例如，8-羥基喹啉是弱熒光物質，當與Zn2+、Mg2+、Al3+螯合后，熒光就增強。相反，如果原來結構中平面性較好，但分子上取代了較大基團后，由于位阻的原因，使分子的共平面性下降，因而熒光減弱。表1-12表明1-二甲胺基萘-8-磺酸鹽的熒光效率最低，這是因為磺酸基團與二甲胺基之間的位阻效應，使分子發(fā)生扭轉，兩個環(huán)不能共平面，因而使熒光大大減弱。

同理，對于順反異構體，順式分子的兩個基團在同一側，由于位阻原因不能共平面，而沒有熒光。例如，1，2-二苯乙烯的反式異構體有強烈熒光，而順式異構體沒有熒光。

（4）取代基效應　芳香環(huán)上的不同取代基對該化合物的熒光強度和熒光光譜有很大影響。通常給電子基團使熒光增強，如—OH、—NH2、—NR2、—OR等；而同π電子體系相互作用較小的取代基如—SO3H和烷基對分子熒光影響不明顯；吸電子基團，如—COOH、—CO、—NO2、—NO、—NN—及鹵素會減弱甚至破壞熒光。

了解熒光和物質分子結構的關系，可以幫助我們考慮如何將非熒光物質轉化為熒光物質，或將熒光強度不大或選擇性較差的熒光物質轉化為熒光強度大及選擇性好的熒光物質，以提高分析測定的靈敏度。

1.4.2.5　儀器的靈敏度

分光熒光計的靈敏度與三個方面有關：①與儀器的光源強度、單色器（包括透鏡、反射鏡等）的性能、放大系統(tǒng)的特征和光電倍增管的靈敏度有關；②和所選用的波長及狹縫寬度有關；③和被測定的空白溶劑的拉曼散射、激發(fā)光、雜質熒光等有關。由于影響熒光計靈敏度的因素很多，同一型號的儀器，甚至同一臺儀器，在不同時間操作所測得的結果也不盡相同。目前，熒光分析儀器的靈敏度趨向使用純水的拉曼峰信噪比（S/N）表示。以純水拉曼峰高為信號值（S），確定發(fā)射波長，使記錄儀進行時間掃描，測出儀器的噪聲信號（N），用S/N的值作為衡量儀器靈敏度的指標。一般其值在20～200之間，此法應用比較廣泛。

1.4.2.6　激發(fā)光譜和熒光光譜的形狀及其相互關系

（1）激發(fā)光譜　如果將激發(fā)光的光源用單色器分光，測定不同波長的激發(fā)光照射下，熒光最強的波長處熒光強度的變化，以激發(fā)波長λ為橫坐標，熒光強度IF為縱坐標作圖，便可得到熒光物質的激發(fā)光譜。

（2）發(fā)射光譜　簡稱熒光光譜。如果將激發(fā)光波長固定在最大激發(fā)波長處，而讓物質發(fā)射的熒光通過單色器分光，以測定不同波長的熒光強度。以熒光的波長λ作橫坐標，熒光強度IF為縱坐標作圖，便得到熒光光譜。如圖1-44所示。

熒光物質的最大激發(fā)波長（λex）和最大熒光波長（λem）數(shù)據(jù)，也是定量測定時最靈敏的條件。比較蒽的熒光光譜和激發(fā)光譜（吸收光譜）的形狀可見，熒光光譜和激發(fā)光譜呈現(xiàn)大致的鏡像對稱關系。蒽的乙醇溶液有兩個吸收帶：一個峰在250nm波長處的吸收帶，相應從基態(tài)到第二激發(fā)態(tài)的躍遷；另一個峰在350nm波長處的吸收帶，相應從基態(tài)到第一激發(fā)態(tài)的躍遷。但由于內(nèi)轉換及振動弛豫的速度遠遠大于由S2返回基態(tài)發(fā)射熒光的速度，故在熒光發(fā)射時，不論用哪一個波長的光輻射激發(fā)，電子都從第一激發(fā)態(tài)的最低振動能級回至基態(tài)的各個振動能級，所以熒光光譜只能出現(xiàn)一個譜帶。即無論用λ1、λ2或λ3波長激發(fā)，熒光光譜的形狀、位置都相同。熒光光譜是受激分子從S1的最低振動能級回至基態(tài)中各振動能級所致，其形狀決定于基態(tài)的振動能級的分布情況。由于激發(fā)態(tài)與基態(tài)的振動能級分布類似，因此熒光光譜和激發(fā)光譜形狀相似，呈鏡像對稱。

1.4.3　分子熒光光譜的定量分析

1.4.3.1　熒光強度與溶液濃度的關系

當一束強度為I0的紫外光照射一盛有濃度為c、厚度為l的液池時，可在液相的各個方向觀察到熒光，其強度為IF，透射光強度為It，吸收光強度Ia。由于激發(fā)光的一部分能透過液池，因此，一般在激發(fā)光源垂直的方向測量熒光強度（IF），見圖1-45。溶液的熒光強度和該溶液的吸收光強度以及熒光物質的熒光效率有關。

IF=ΦFIa

根據(jù)Lambert-Beer定律：

Ia=I0-It

=10-εlc

It=I0×10-εlc

Ia=I0-I0×10-εlc=I0（1-e-2.303εlc）

對于很稀的溶液，將上式按Taylor展開，并作近似處理后可得

IF=2.303ΦFI0εlc

當熒光效率（ΦF）、入射光強度（I0）、物質的摩爾吸光系數(shù)（ε）、液層厚度（l）固定不變時，熒光強度（IF）與溶液的濃度（c）成正比。可寫成

IF=Kc　　（1-26）

式（1-26）即為熒光分析的定量基礎。但這種關系只有在極稀的溶液中，當εlc<0.05時才成立。對于εlc>0.05較濃的溶液，由于熒光猝滅現(xiàn)象和自吸收等原因，使熒光強度與濃度不呈線性關系，熒光強度與濃度的關系向濃度軸偏離。

1.4.3.2　測定條件的選擇

（1）選擇合適的激發(fā)光波長和熒光波長　一般選擇激發(fā)光譜中能產(chǎn)生最強熒光的入射光波長作為激發(fā)光，稱為最大激發(fā)波長（λex）。根據(jù)熒光光譜選擇最強熒光的波長作為熒光測定的波長。

（2）選擇線性范圍　當熒光物質溶液的吸光度A≤0.05時，熒光強度和濃度才呈線性關系。當高濃度（A>0.05）時，由于自淬滅和自吸收等原因，使熒光強度和濃度不呈線性，發(fā)生負偏差。因此分析時應注意在校正曲線的線性范圍內(nèi)進行。

1.4.3.3　定量分析方法

（1）校正曲線法　配成一系列不同濃度的標準溶液。然后，測出標準溶液的相對熒光強度和空白溶液的相對熒光強度。以相對熒光強度為縱坐標、標準溶液濃度為橫坐標，繪制校正曲線；然后將處理后的試樣，配成一定濃度的溶液，在同一條件下測定其熒光強度，從校正曲線上求出試樣中熒光物質的含量。

為了使一個實驗在不同時間所測的數(shù)據(jù)前后一致，在測繪校正曲線時或者在每次測定試樣前，常用一個穩(wěn)定的熒光物質（其熒光峰與試樣的熒光峰相近）的標準溶液作為基準進行校正。例如，在測定維生素B1時，采用硫酸奎寧作基準。

（2）比較法　取已知量純熒光物質配成在線性范圍內(nèi)的標準溶液，測出熒光強度（IF（s）），然后在同樣條件下測定試樣溶液的熒光強度（IF（x））。分別扣除空白（IF（0））的含量。以標準溶液和試樣溶液的熒光強度比，求試樣中熒光物質。

=　　（1-27）

cx=cs　　（1-28）

（3）多組分混合物的熒光分析　如果混合物中各組分熒光峰相互不重疊，則可分別在不同波長測量各個組分的熒光強度，從而直接求出各個組分的濃度。Al3+和Ga3+的8-羥基喹啉配合物的氯仿萃取液熒光峰均為520nm，但激發(fā)峰不同，可分別在365nm及435.8nm激發(fā)，在520nm處測定互不干擾。若不同組分的熒光光譜相互重疊，則可利用熒光強度的加合性質，在適宜波長處測量混合物的熒光強度，再根據(jù)被測物質各自在適宜波長處的最大熒光強度，列出聯(lián)立方程，求它們各自的含量（可參見紫外-可見分光光度法多組分混合物的定量分析）。

1.4.4　影響熒光光譜強度的因素

熒光分子所處的外部化學環(huán)境，如溫度、溶劑、pH等都會影響熒光效率，因此選擇合適的條件不僅可以使熒光加強，提高測定的靈敏度，還可以控制干擾物質的熒光產(chǎn)生，提高分析的選擇性。

（1）溫度的影響　大多數(shù)熒光物質的溶液隨著溫度降低，熒光效率和熒光強度將增加；相反，溫度升高，熒光效率將下降。如熒光素的乙醇溶液在0℃以下每降低10℃，熒光效率增加3%；冷至-80℃，熒光效率為100%。這是由于當溫度降低時，溶液中分子的活動性減弱，溶劑化度降低，溶質分子與溶劑分子間碰撞機會減少，降低了無輻射去活概率，使熒光效率增加。

（2）溶劑的影響　溶劑對熒光強度和形狀的影響主要表現(xiàn)在溶劑的極性、氫鍵及配位鍵的形成等。溶劑極性增大時，通常使熒光波長紅移。氫鍵及配位鍵的形成更使熒光強度和形狀發(fā)生較大的變化。含有重原子的溶劑，如CBr4和CH3CH2I等也可使熒光強度減弱。

（3）溶液pH的影響　當熒光物質本身是弱酸或弱堿時，其熒光強度受溶液pH值的影響較大。例如苯胺在pH=7～12溶液中會發(fā)生藍色熒光，在pH<2或pH>13的溶液中都不發(fā)生熒光。有些熒光物質在離子狀態(tài)無熒光，而有些則相反；也有些熒光物質在分子和離子狀態(tài)時都有熒光，但熒光光譜不同。

（4）溶液熒光的猝滅　熒光物質分子與溶劑分子或其他溶質分子相互作用，引起熒光強度降低、消失或熒光強度與濃度不呈線性關系的現(xiàn)象，稱為熒光猝滅。引起熒光猝滅的物質稱為猝滅劑，如鹵素離子、重金屬離子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物等均為常見的猝滅劑。

引起熒光猝滅的因素很多。碰撞猝滅是熒光猝滅的主要原因，它是指處于單重激發(fā)態(tài)的熒光分子與猝滅劑碰撞后，使激發(fā)態(tài)分子以無輻射躍遷回到基態(tài)，因而產(chǎn)生猝滅作用。除碰撞猝滅外，還有靜態(tài)猝滅、轉為三重態(tài)的猝滅、自吸猝滅等。靜態(tài)淬滅是指熒光分子與淬滅劑生成不能產(chǎn)生熒光的物質。O2是最常見的猝滅劑，熒光分析時需要除去溶液中的氧。熒光分子由激發(fā)單重態(tài)轉入激發(fā)三重態(tài)后也不能發(fā)生熒光。濃度高時，熒光分子發(fā)生自吸收現(xiàn)象也是發(fā)生熒光淬滅的原因之一。熒光物質的熒光光譜與吸收光譜重疊時，熒光被溶液中處于基態(tài)的分子吸收，稱為自吸收。

1.4.5　分子熒光光譜在高分子材料分析中的應用

熒光光譜法應用在高分子材料研究中雖然只有20年的歷史，然而其應用已深入到高分子科學中許多領域。由于其靈敏度極高，在高分子溶液、共混物等方面的研究十分引人注目。

1.4.5.1　高分子在溶液中的形態(tài)轉變

合成聚合物的激基締合物熒光最早是在聚苯乙烯溶液中發(fā)現(xiàn)的，聚苯乙烯在溶液中的激基締合作用已被許多學者所研究。所謂高分子溶液中的激基締合物，是指對于像聚苯乙烯這類聚合物中的苯環(huán)或其他芳環(huán)等具有平面π電子共軛結構的發(fā)色基團，除單獨存在外，還有可能出于分子鏈處于某種構象時，鄰近的兩平面結構相互平行靠近產(chǎn)生相互作用，從而形成一種激基締合物（eximer）。這種激基締合物吸光后發(fā)出了不同于單獨發(fā)色基團（monomer）的異常熒光。反映在熒光譜圖上，就表現(xiàn)為聚合物（如聚苯乙烯）溶液的熒光譜峰與相應的結構單元（如乙苯）的熒光譜峰有明顯不同。

1.4.5.2　高分子共混物的相容性和相分離

不同品種的高分子均聚物共混，有可能獲得具有新的功能，或綜合兩者優(yōu)點的新材料體系。自20世紀70年代以來，這一領域的研究有了很快的發(fā)展。組成共混物的高分子間若存在特殊相互作用，包括氫鍵、偶極-偶極、離子-離子、電荷轉移絡合等，便會產(chǎn)生有利于互相溶解的混合焓，因而形成相容體系。用熒光光譜法表征高分子共混體系的相容性主要有兩種方法：激基締合物法和Forster能量轉移法。

Frank發(fā)展了用含芳香基均聚物的激基締合物來研究高聚物相容性的技術。用0.2%聚-乙烯萘與不同的聚烷基丙烯酸甲酯共混，發(fā)現(xiàn)隨兩組分溶度參數(shù)差增大而升高。當溶度參數(shù)差接近零時，最小，表明兩組分以分子水平相容。后來Frank又將該技術用于研究PS/乙烯基甲基醚共混物的相分離。對于聚苯乙烯-聚乙烯基甲基醚體系，從甲苯溶液中成膜表現(xiàn)出相容的性質，從THF溶液中成膜則出現(xiàn)相分離。在相同的聚苯乙烯含量時，相分離體系的遠高于相容體系。錢人元等發(fā)現(xiàn)，對從甲苯中成膜的聚苯乙烯-聚乙烯基醚體系，聚苯乙烯含量低于5%（質量分數(shù)）時，為一常數(shù)，小于聚苯乙烯在良溶劑中的數(shù)值，這表明兩種聚合物以分子水平相容。

江明等用熒光光譜法研究了含氫鍵體系的相容性。所用的含熒光生色團的聚合物是乙烯基萘（VN，90%）和少量甲基丙烯酸甲酯（MMA）的共聚物（PVM），后者提供了與對應聚合物生成氫鍵的羰基，與之共混的對應聚合物為含羰基的聚苯乙烯[PS（OH）]在羥基含量很低時，幾乎不隨—OH的含量而改變，表明了PVM在PS（OH）中的狀態(tài)是獨立成形的。在羥基含量較高（>2.8%）時，在一個低值的水平上保持不變，這表明體系中形成激基締合物的可能性大為減少，即PVM已和PS（OH）充分貫穿和均勻混合了。介于此兩區(qū)域之間，明顯的存在一個轉變區(qū)。氫鍵作用的增強使PVM鏈由自身聚集的狀態(tài)過渡到在PS（OH）基質中的充分均勻混合。熒光光譜法給出的如此低含量下的相容行為的變化，是其他相容性技術如DSC或動態(tài)力學方法等所無法觀察到的。

激基締合物法僅適用于研究含生色團的均聚物的共混體系。而Forster能量轉移法卻具有更普遍的意義。這一方法的基本原理在于：當某種體系中同時存在一種熒光能量給體D（donor）和一種能量受體A（acceptor）時，它們之間的能量轉移效率E與其間的距離的6次方成反比，即E=1/[1+（D/R0）6]。這里的D是兩生色團之間的距離，R0是所謂特征距離，它取決于D的發(fā)射光譜和A的吸收光譜間重疊的程度及體系的折光指數(shù)等。對給定的體系來說，它是一個常數(shù)。通常R0值為2～4nm，由于生色團間的能量轉移效率強烈依賴于兩者距離，如將兩種熒光生色基團分別標記到兩種聚合物上，則可通過其能量轉移效率的變化來了解2～4nm尺度下異種分子間相互混合的程度。顯然，體系由相分離狀態(tài)向相容性狀態(tài)變化時，其能量轉移效率將有較大的增加，因為前者只有在兩相界面上才發(fā)生能量轉移。

1.4.5.3　研究高聚物的降解與老化

高聚物的降解和老化過程可以利用中間和最終產(chǎn)物中基團的熒光光譜變化進行動態(tài)的描述。圖1-46給出了某種聚酯膜在300℃經(jīng)不同時間熱降解后在330nm波長激發(fā)時的熒光發(fā)射光譜。結果顯示熱降解后熒光發(fā)射強度明顯增加，發(fā)射波長隨熱處理時間的延長而紅移（由1h的38nm移至5h的415nm），同時熱處理2h后在450nm處出現(xiàn)寬肩峰。這些結果表明熱老化過程由兩個協(xié)同效應組成，即經(jīng)熱分解化作用形成單羥基單元，隨之快速發(fā)生雙羥基化反應生成雙羥基單元。聚酯膜經(jīng)紫外光降解不同時間后在330nm波長激發(fā)時的熒光發(fā)射光譜見圖1-47，其變化與熱老化不同。光降解后在460nm處的熒光發(fā)射強度雖處理時日的延長而顯著增強，但無紅移現(xiàn)象，由此表明光降解后主要的反應是單羥基化的快速反應，僅生成極少量的雙羥基單元；進一步分析還說明光老化在形成高聚物的短鏈段的同時伴有結構的重排和聚集。

1.4.5.4　發(fā)光聚合物材料的熒光光譜研究

為研究聚合物發(fā)光材料，往往將小分子發(fā)光物質引入聚合物長鏈中。例如，圖1-48顯示出取代肉桂酸單體銪鹽與相應的聚合物的熒光譜，其激發(fā)光波長固定在241.1nm。曲線1為取代肉桂酸單體銪鹽，曲線2為其聚合物。可見，取代肉桂酸單體銪鹽的熒光強度大，聚合后熒光減弱，在700nm處峰的變化尤為明顯。銪（Eu）是稀土金屬，具有一定數(shù)目的共軛單體的低分子有機配體與稀土金屬鹽形成的有機鹽類有較高的發(fā)光效率，其單體聚合后，由于羧酸鹽基聚集引起亞微觀的不均勻性，導致Eu3+的熒光部分淬滅，致使熒光強度減弱。

1.4.5.5　常用熒光試劑及使用范圍

目前分子熒光分析法被廣泛用于高分子材料分析中。分子熒光分析已經(jīng)成為了非常靈敏的測定方法。

常用的熒光試劑見表1-13。