第3章　細胞生物學研究方法

3.1　名校考研真題

一、選擇題

1．（　　）技術(shù)為細胞生物學的早期形成奠定了良好的基礎(chǔ)。[中國科學院大學2016研]

A．組織培養(yǎng)

B．高速離心

C．激光掃描共聚焦顯微鏡

D．電子顯微鏡

【答案】D

2．冰凍蝕刻技術(shù)主要用于（　　）。[南開大學2011研]

A．電子顯微鏡

B．光學顯微鏡

C．原子力顯微鏡

D．激光共聚焦顯微鏡

【答案】A

【解析】主要電鏡制樣技術(shù)包括：超薄切片技術(shù)、負染色技術(shù)、冷凍蝕刻技術(shù)、電鏡三維重構(gòu)技術(shù)和掃描電鏡技術(shù)等。

3．正常細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基中常需加入血清，主要是因為血清中含有（　　）。[浙江師范大學2011研]

A．氨基酸

B．核酸

C．生長因子

D．維生素

【答案】C

【解析】血清中含有促細胞分裂因子，以及有利于貼壁生長的黏附分子。

4．建立分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞是通過下列哪種技術(shù)構(gòu)建的？（　　）[湖南大學2007、南開大學2011研]

A．細胞融合

B．核移植

C．病毒轉(zhuǎn)化

D．基因轉(zhuǎn)移

【答案】A

【解析】雜交瘤細胞是利用瘤細胞與特異性抗原免疫的B淋巴細胞進行細胞融合制得的。

5．（多選）以下哪些技術(shù)一般不用于分離活細胞？（　　）[廈門大學2011研]

A．流式細胞術(shù)

B．細胞電泳

C．超速離心

D．差速離心

【答案】CD

【解析】C項，超速離心機用于分離或分析鑒定病毒顆粒、細胞器或大分子生物樣品等。D項，差速離心是利用不同的離心速率產(chǎn)生的不同離心力，將各種亞細胞組分和各種顆粒分離開來，適于分離沉降速率差別較大的亞顯微結(jié)構(gòu)顆粒。

6．關(guān)于光鏡的使用，下列哪項有誤？（　　）[南京師范大學2008研]

A．觀察標本時，應雙眼同時睜開、雙手并用

B．按照從低倍鏡到高倍鏡到油鏡的順序進行操作

C．使用油鏡時，需在標本上滴香柏油，將聚光器降至最低，光圈關(guān)至最小

D．使用油鏡時，不可一邊在目鏡中觀察，一邊下降鏡筒或上升載物臺

【答案】C

7．動物細胞在體外培養(yǎng)條件下生長情況是（　　）。[中國科學院2005研]

A．能無限增殖

B．不能增殖分裂而很快死亡

C．經(jīng)過有限次數(shù)分裂后最終都要死亡

D．一般進行有限次數(shù)分裂后死亡，但少數(shù)情況下有些細胞發(fā)生了遺傳突變，獲得了無限增殖的能力

【答案】D

【解析】正常的動物細胞在體外進行培養(yǎng)時，會出現(xiàn)接觸抑制現(xiàn)象，原代培養(yǎng)的細胞一般傳至10代就會衰老、死亡。部分細胞可傳代至40～50代，仍能保持染色體二倍性和接觸抑制行為，少數(shù)動物細胞體外條件培養(yǎng)50代以上可能細胞發(fā)生突變，帶有癌細胞特點。發(fā)生變異的癌細胞在體外條件培養(yǎng)能無限增殖，喪失接觸抑制行為。

8．適用于觀察培養(yǎng)細胞的光學顯微鏡是（　　）。[復旦大學2004研]

A．復式顯微鏡

B．暗視野顯微鏡

C．熒光顯微鏡

D．相差顯微鏡

E．倒置顯微鏡

【答案】E

9．（多選）某研究生為了研究一特定膜蛋白的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的功能，需要制備和分離外翻的細胞膜泡，為了獲得無污染的外翻膜泡，下列選項中，哪些是他在實驗中有可能使用到的？（　　）[中山大學2008研]

A．SDS

B．凝集素

C．流式細胞儀

D．柱層析

【答案】BD

【解析】BD兩項，使用對胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域具有特異性的凝集素富集外翻的細胞膜泡，然后通過柱層析的方法獲得無污染的外翻膜泡。A項，SDS會打破細胞膜的正常結(jié)構(gòu)并且不易除去。C項，流式細胞儀只能在細胞水平進行分離。

10．（多選）綠色熒光蛋白GFP（Green Fluorescent Protein）基因與目的基因融合后，轉(zhuǎn)入細胞后可以（　　）。[中科院-中科大2004研]

A．檢測融合蛋白質(zhì)在細胞中的準確定位

B．檢測目的基因所編碼的蛋白在細胞中的含量

C．檢測目的基因所編碼的蛋白在細胞中的分子結(jié)構(gòu)

D．檢測目的蛋白質(zhì)在細胞中的表達量

E．以上答案都不對

【答案】ABD

【解析】與綠色熒光蛋白形成融合蛋白后，目的基因編碼蛋白隨著綠色熒光蛋白的顯色而被跟蹤，熒光的強弱能反映目的蛋白的表達情況及其在細胞中的含量。

二、填空題

1．電子顯微鏡按照功能分為______和______兩種，倒置顯微鏡與正置顯微鏡的區(qū)別在于______。[中國科學院大學2017研]

【答案】掃描電子顯微鏡；透射電子顯微鏡；物鏡的朝向不同（正置朝下，倒置朝上）

2．流式細胞儀可以定量測定細胞中的______、______或某種特異蛋白的含量，以及細胞群體中上述成分含量不同的細胞數(shù)量。[南京師范大學2008研]

【答案】DNA；RNA

3．從創(chuàng)新的觀點看，1665年胡克發(fā)現(xiàn)細胞的兩個主要創(chuàng)新點是：______創(chuàng)新和______創(chuàng)新。[中山大學2007研]

【答案】切片技術(shù)；光學顯微技術(shù)

4．動物細胞離體培養(yǎng)方式主要有3種：______、______、______。[山東大學2006研]

【答案】群體培養(yǎng)；克隆培養(yǎng)；轉(zhuǎn)鼓培養(yǎng)

5．細胞拆合的方法有______和______兩種。[山東大學2006研]

【答案】物理法；化學法

6．體外培養(yǎng)的細胞，不論原代細胞還是傳代細胞一般不保持體內(nèi)原有的細胞形態(tài)。但大體可以分為兩種基本形態(tài)：______與______。[鄭州大學2005、2006研]

【答案】成纖維樣細胞；上皮樣細胞

7．體外培養(yǎng)動物細胞生長特點______、______。[山東大學2006研]

【答案】單層貼壁生長；接觸抑制

三、判斷題

1．PCR技術(shù)主要用熱穩(wěn)定的DNA聚合酶，擴增過程中雙鏈DNA必須加熱變性。（　　）[中國科學院大學2016研]

【答案】對

2．細胞冷凍與細胞復蘇的基本原則是：快速冷凍、緩慢復蘇。（　　）[中國科學院大學2016研]

【答案】錯

3．正常細胞培養(yǎng)中除了培養(yǎng)基外常加入血清，主要是因為血清中含有大量氨基酸。（　　）[廈門大學2011研]

【答案】錯

【解析】正常細胞培養(yǎng)中除了培養(yǎng)基外常加入血清，主要是因為血清中含有大量生長因子。

4．雖然龜?shù)淖罡邏勖?75歲，而小鼠的壽命只有幾年，但它們的細胞在體外培養(yǎng)時分裂的極限基本相同。（　　）[浙江師范大學2010研]

【答案】對

【解析】任何動物細胞的培養(yǎng)均需從原代細胞培養(yǎng)做起。原代培養(yǎng)的細胞一般傳10代左右就不易傳下去了，大部分細胞生長停滯、衰老死亡，有極少數(shù)細胞可存活，并能順利地傳40～50代次，仍保持原來染色體的二倍體數(shù)量及接觸抑制的行為，一般情況下，傳至50代以后細胞就不能再傳下去了。

5．體外培養(yǎng)的細胞，一般保持體內(nèi)原有的細胞形態(tài)。（　　）[南京師范大學2008研]

【答案】錯

【解析】細胞在體外培養(yǎng)所處的環(huán)境與體內(nèi)的環(huán)境存在著很大的差別，即使細胞能在體外大量培養(yǎng)，但其形態(tài)結(jié)構(gòu)還存在著差異。

6．經(jīng)冷凍蝕刻技術(shù)處理后的樣品，在電子顯微鏡下所觀察到的圖像是樣品本身所形成的。（　　）[南開大學2007研]

【答案】錯

【解析】經(jīng)冷凍蝕刻技術(shù)處理后的樣品，在電子顯微鏡下所觀察到的圖像是金屬膜和碳膜成像。

7．經(jīng)流式細胞儀分離出的細胞可繼續(xù)培養(yǎng)。（　　）[上海交通大學2007研]

【答案】對

【解析】只要染色過程不影響細胞活性，則分離出來的細胞還可以繼續(xù)培養(yǎng)。

8．在單克隆技術(shù)中，將產(chǎn)生抗體的B淋巴細胞與腫瘤細胞雜交，在HAT選擇性培養(yǎng)基中保留下來的細胞，可以是正常細胞與腫瘤細胞的單克隆融合細胞，還可以是多克隆雜交的細胞的混合群體，但不可能是未融合的腫瘤細胞或正常細胞之間的混合體。（　　）[中科院-中科大2005研]

【答案】對

【解析】骨髓瘤細胞中缺乏TK或HGPRT，在含有氨基嘌呤的培養(yǎng)液中不能存活，只有融合細胞才能在含HAT的培養(yǎng)液內(nèi)通過旁路合成核酸而得以生存。

四、名詞解釋題

1．基因編輯[浙江大學2017研]

答：基因編輯是指可以精確地定位到基因組的某一位點上，在這位點上剪斷靶標DNA片段并插入新的基因片段來對基因組進行定點修飾的一項新技術(shù)。基因編輯技術(shù)能夠讓人類對目標基因進行“編輯”，實現(xiàn)對特定DNA片段的敲除、加入等。而CRISPR/Cas9技術(shù)自問世以來，就有著其它基因編輯技術(shù)無可比擬的優(yōu)勢，技術(shù)不斷改進后，更被認為能夠在活細胞中最有效、最便捷地“編輯”任何基因。

2．細胞系與細胞株[南京師范大學2007研]

相關(guān)試題：cell line[中國科學院大學2017研]

答：（1）原代培養(yǎng)的細胞傳到10代左右就不容易傳下去了，細胞生長出現(xiàn)停滯，大部分細胞衰老死亡，但是極少數(shù)細胞可能渡過“危機”而傳下去。這些存活的細胞又可以順利地傳40～50代，并且仍然保留了原來染色體的二倍體數(shù)量和接觸抑制的行為，很多學者把這種傳代細胞稱為細胞系。當細胞傳代至50代時，又要出現(xiàn)一次“危機”，突破這次“危機”并且能夠繼續(xù)傳代下去的細胞，一般發(fā)生了遺傳突變，具備了癌細胞的特點，稱為永生細胞系。

（2）細胞株是指通過選擇法或克隆法從原代培養(yǎng)或細胞系中獲得的具有特殊性質(zhì)或標記物的細胞培養(yǎng)物。細胞株是通過單細胞分離培養(yǎng)和篩選由單細胞形成的細胞群。細胞株的特殊性質(zhì)或標記物必須在整個培養(yǎng)期間一直存在。

3．細胞融合（cell fusion）[中國科學院大學2017研，鄭州大學2004、2008研]

答：細胞融合是指兩個或多個細胞融合成一個雙核或多核細胞的過程，常需對細胞進行預處理或者借助某些化學物質(zhì)和滅活病毒介導完成。如動物細胞融合一般要用滅活的病毒（如仙臺病毒）或化學物質(zhì)（如PEG）介導；植物細胞融合時，要先用酶去掉細胞壁。細胞融合技術(shù)是單克隆抗體制備等的基礎(chǔ)。

4．monoclonal antibody[武漢大學2006研]

相關(guān)試題：單克隆抗體[中國科學院大學2017研]

答：monoclonal antibody的中文名稱是單克隆抗體，是指將產(chǎn)生抗體的B淋巴細胞與小鼠的骨髓瘤細胞在聚乙二醇或滅活的病毒的介導下融合產(chǎn)生雜交瘤細胞，產(chǎn)生的雜交瘤細胞既具有分泌抗體的功能，又可在體外培養(yǎng)條件下或移植到體內(nèi)無限增殖的技術(shù)。單克隆抗體技術(shù)最主要的優(yōu)點是可以用混合性的異質(zhì)抗原制備出針對某單一性抗原分子上特異決定族的同質(zhì)性單克隆抗體，它與基因克隆技術(shù)相結(jié)合為分離和鑒定新的蛋白質(zhì)和基因開辟了一條廣闊途徑，而且在臨床診斷與腫瘤等疾病的治療中也具有重要作用。

5．microscopic structure[中國科學院大學2017研]

答：microscopic structure的中文名稱是顯微結(jié)構(gòu)，是指在普通光學顯微鏡中能夠觀察到的細胞結(jié)構(gòu)。細胞中的結(jié)構(gòu)如染色體、葉綠體、線粒體、核仁等結(jié)構(gòu)的大小均超過0.2微米，用普通光學顯微鏡都能看到，因而這些結(jié)構(gòu)屬于細胞的顯微結(jié)構(gòu)。

6．亞顯微結(jié)構(gòu)[中國科學院大學2016研]

答：亞顯微結(jié)構(gòu)又稱超微結(jié)構(gòu)，是指在普通光學顯微鏡下觀察不能分辨清楚，但在電子顯微鏡下能觀測到的細胞內(nèi)各種微細結(jié)構(gòu)（普通光學顯微鏡的分辨力極限約為0.2微米，細胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和核膜的厚度，核糖體、微體、微管和微絲的直徑等均小于0.2微米），如各種細胞器。

7．原位雜交[浙江大學2016研，湖南大學2007研]

答：原位雜交是一種應用核酸標記探針與組織細胞中的待測物質(zhì)雜交，再用與標記物相關(guān)的檢測系統(tǒng)，檢測出特異性核苷酸序列在染色體上或在細胞中位置的方法。其基本原理是在適宜的條件下，應用帶有標記的DNA或RNA片段作為核酸探針，與組織切片或細胞內(nèi)待測核酸（RNA或DNA）片段進行雜交，然后可用放射自顯影等方法予以顯示，在光鏡或電鏡下觀察目的mRNA或DNA的存在并定位；用原位雜交技術(shù)，可在原位研究細胞合成某種多肽或蛋白質(zhì)的基因表達。

8．免疫共沉淀[浙江大學2015研]

答：免疫共沉淀是指以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法，是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。當細胞在非變性條件下被裂解時，完整細胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。當用預先固化在瓊脂糖小球上的蛋白質(zhì)A的抗體免疫沉淀A蛋白，那么與A蛋白在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)B也能一起沉淀下來。再通過蛋白變性分離，對B蛋白進行檢測，進而證明兩者間的相互作用。

9．人造微小染色體[浙江大學2015研]

答：人造微小染色體是指采用分子克隆技術(shù)把真核細胞染色體的復制起點、著絲粒和端粒的DNA片段分別克隆成功，并且把它們互相搭配或改造而構(gòu)成的人工染色體結(jié)構(gòu)。人造微小染色體現(xiàn)僅限于酵母菌系統(tǒng)的研究。

10．RNAi（RNA interference）[廈門大學2011研]

答：RNAi的中文名稱是RNA干擾。RNA干擾是指與靶基因同源的雙鏈RNA誘導的特異轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象。其作用機制是雙鏈RNA被特異的核酸酶降解，產(chǎn)生干擾小RNA（siRNA），這些siRNA結(jié)合其他元件形成“RNA誘導沉默復合物”（RISC），RISC與同源的靶RNA互補結(jié)合，降解靶RNA，從而抑制、下調(diào)基因表達。該方法已經(jīng)發(fā)展成為基因治療、基因結(jié)構(gòu)功能研究的快速而有效的方法。

11．接觸抑制[浙江師范大學2011研]

答：接觸抑制是指在細胞培養(yǎng)過程中，當貼壁生長的單層細胞分裂、生長到表面相互接觸時，就會停止增殖，維持相互接觸的單層細胞狀態(tài)直至衰老的現(xiàn)象。接觸抑制現(xiàn)象的形成是因為：細胞膜上有糖類和蛋白質(zhì)共同構(gòu)成的糖蛋白即糖被，在細胞上起識別作用。當細胞增殖到一定程度，即互相挨在一起時，糖蛋白可以識別這種信息，從而使細胞停止繼續(xù)繁殖。

12．超微結(jié)構(gòu)（ultra-structure）[中科院-中科大2007研]

答：超微結(jié)構(gòu)即亞顯微結(jié)構(gòu)，是指在電子顯微鏡下所觀察到的細胞結(jié)構(gòu)，如細胞核、線粒體、高爾基體、中心體、核糖體、微管、微絲等細胞器的微細結(jié)構(gòu)。這些細胞內(nèi)的各種微細結(jié)構(gòu)在普通光學顯微鏡下不能分辨清楚，必須用分辨力更高的電子顯微鏡。

13．density gradient centrifugation[南開大學2007年]

答：density gradient centrifugation的中文名稱是密度梯度離心。密度梯度離心依據(jù)不同的生物大分子在浮力密度上的差異，用一種能在離心場內(nèi)自行形成并保持穩(wěn)定的密度平衡溶液，經(jīng)過足夠時間離心后，各分離物質(zhì)可分別達到相當于自身浮力密度的平衡位置，從而達到分離的目的。

14．基因打靶[山東大學2005研]

答：基因打靶是指通過同源重組將外源基因定點整合入靶細胞基因組上某一確定的位點，達到定點修飾改造染色體上某一基因的一項技術(shù)。基因打靶技術(shù)是一種定向改變生物活體遺傳信息的實驗手段，通過對生物活體遺傳信息的定向修飾包括基因滅活、點突變引入、缺失突變、外源基因定位引入、染色體組大片段刪除等，并使修飾后的遺傳信息在生物活體內(nèi)遺傳，表達突變的性狀，從而可以研究基因功能等生命科學的重大問題，以及提供相關(guān)的疾病治療、新藥篩選評價模型等。

15．基因敲除[南開大學2005研]

答：基因敲除是指通過基因工程的方法使目的基因功能喪失的人工定向突變技術(shù)。多用于各種遺傳疾病的研究，如研究特定基因的細胞生物學活性、研究發(fā)育調(diào)控的基因作用和確定信號通路分子的上下游關(guān)系等。

16．GFP[上海交通大學2005研]

答：GFP的中文名稱是綠色熒光蛋白，是指在水母中發(fā)現(xiàn)的，在藍色波長范圍的光線激發(fā)下，會發(fā)出綠色熒光的蛋白質(zhì)。其在氧化狀態(tài)下產(chǎn)生熒光，強還原劑能使GFP轉(zhuǎn)變?yōu)榉菬晒庑问健FP作為一種基因標志，可以進行蛋白質(zhì)定位，研究蛋白質(zhì)的分布、合成和降解以及運動等性質(zhì)。

五、簡答題

1．試比較光學顯微鏡和電子顯微鏡的區(qū)別。[中國科學院大學2016研]

答：光學顯微鏡和電子顯微鏡的區(qū)別如表1所示。

表1

2．說明細胞培養(yǎng)的基本原理和方法。如何進行小白鼠脾細胞原代培養(yǎng)？如何判斷死活細胞的比率？[山東大學2005研]

相關(guān)試題：請描述動物原代細胞培養(yǎng)的主要方法和基本原理，并說明細胞傳代過程中活細胞率的鑒定方法。[山東大學2015研]

答：（1）細胞培養(yǎng)的基本原理和方法

①原理

細胞培養(yǎng)是將從機體中取出的細胞，置于一定的生長基質(zhì)之中，并給予恒定的培養(yǎng)環(huán)境，使這些細胞在體外繼續(xù)生長和分裂的技術(shù)。

②方法

a．群體培養(yǎng)：將含有一定數(shù)量細胞的懸液置于培養(yǎng)瓶中，讓細胞貼壁生長，匯合后形成均勻的單細胞層。

b．克隆培養(yǎng)：將高度稀釋的游離細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，各個細胞貼壁后，彼此距離較遠，經(jīng)過生長增殖每一個細胞形成一個細胞集落，一個集落稱為一個克隆。

（2）小白鼠脾細胞的原代培養(yǎng)

首先從健康小白鼠體內(nèi)取出脾細胞，剪碎，用濃度和活性適中的胰酶或膠原酶與EDTA等將細胞連接處消化分散，給予良好的營養(yǎng)液與無菌的培養(yǎng)環(huán)境（接近體溫與體內(nèi)pH），在培養(yǎng)瓶中進行靜止或慢速轉(zhuǎn)動培養(yǎng)。培養(yǎng)液中加一定量的小牛或胎牛血清，有利于細胞的貼壁生長和分裂。

（3）死活細胞比率的判斷方法

①染色法

染色法分為化學染色法和熒光染色法，根據(jù)死活細胞細胞膜通透性和代謝性差異，染料或使死細胞著色，或使活細胞著色。可通過染色鑒別細胞的死活，從而確定細胞培養(yǎng)的死亡率或存活率。

②儀器分析法

可采用微電極技術(shù)（利用死活細胞膜兩側(cè)電位的差異）、全自動細胞計數(shù)分析儀和流式細胞儀等，對細胞的死活進行精確的批量檢測。

3．細胞生物學研究的常用技術(shù)有哪些？[南京師范大學2008研]

相關(guān)試題：細胞生物學是實驗科學，其研究方法以及創(chuàng)新對推動生命科學的研究發(fā)展有重要意義。根據(jù)你對本學科的了解，請列舉3種不同的細胞生物學研究方法對現(xiàn)代生命科學研究的影響（簡要介紹方法的原理及應用）。[武漢科技大學2013研]

答：細胞生物學研究的常用技術(shù)有：

（1）顯微成像技術(shù)

①顯微成像技術(shù)包括直接成像和間接成像，是細胞生物學最基本的研究方法，可分為光學顯微技術(shù)和電子顯微技術(shù)。

②光學顯微技術(shù)中包括普通雙筒顯微鏡、熒光顯微鏡、相差顯微鏡、暗視野顯微鏡、倒置顯微鏡等。光學顯微技術(shù)是研究細胞顯微結(jié)構(gòu)的重要工具。

③電子顯微鏡技術(shù)中包括透射電子顯微鏡、掃描電子顯微鏡、電子數(shù)碼顯微鏡等。電子顯微鏡技術(shù)是研究亞顯微結(jié)構(gòu)的主要工具。

（2）細胞化學技術(shù)

細胞化學技術(shù)包括酶細胞化學技術(shù)、免疫細胞化學技術(shù)、細胞分選技術(shù)，其中流式細胞分選技術(shù)是細胞生物學和現(xiàn)代生物技術(shù)中的重要研究方法。

（3）細胞工程技術(shù)

細胞工程技術(shù)是細胞生物學與遺傳學的交叉領(lǐng)域，主要利用細胞生物學的原理和方法，結(jié)合工程學的技術(shù)手段，按照人們預先的設(shè)計，有計劃地改變或創(chuàng)造細胞遺傳性。包括體外大量培養(yǎng)和繁殖細胞，或獲得細胞產(chǎn)品、或利用細胞體本身。主要內(nèi)容包括：細胞融合、細胞生物反應器、染色體轉(zhuǎn)移、細胞器移植、基因轉(zhuǎn)移、細胞及組織培養(yǎng)。

（4）分離技術(shù)

分離技術(shù)包括細胞組分的分離和生物大分子的分離，為揭示生物大分子在細胞內(nèi)的空間定位、相互關(guān)系及其功能的研究提供了有力的工具。

4．細胞培養(yǎng)時，如何進行支原體污染的檢測？有何有效措施抑制或消除支原體污染（各列出三種方法）？[湖南大學2007研]

答：支原體是一類缺乏細胞壁的原核細胞型微生物，是目前發(fā)現(xiàn)的最小、最簡單的細胞。大小一般在0.1～0.3μm之間，呈高度多形性，有球形、桿形、絲狀、分枝狀等多種形態(tài)。支原體是細胞培養(yǎng)中最常見的，干擾實驗結(jié)果的一種污染。

（1）常見檢測方法：①相差顯微鏡檢測；②DNA熒光染色法；③電鏡檢測；④3H胸腺嘧啶摻入法；⑤聚合酶鏈反應法；⑥免疫學方法；⑦支原體的培養(yǎng)。

（2）對于支原體污染的細胞，可以采取下列補救措施：①抗生素的使用；②其他化學物質(zhì)的使用；③加溫除菌；④光敏效應；⑤微孔濾膜過濾。

5．細胞工程中，哪些方法可以誘導細胞融合，各有什么特點？[武漢大學2006研]

答：細胞融合是兩個細胞通過質(zhì)膜的接觸并相互融合，形成一個細胞的過程，融合后的細胞只有一個連續(xù)的細胞質(zhì)膜。誘導細胞融合的方法及其特點主要有：

（1）生物方法

某些病毒如仙臺病毒等的被膜中有融合蛋白，可介導病毒同宿主細胞融合，也可介導細胞與細胞的融合，因此可以用紫外線滅活的此類病毒誘導細胞融合。

其具有溫和高效的優(yōu)點，但是也存在病毒制備困難，操作復雜，滅活病毒效價差異大，實驗重復性差，融合效率低的缺點。

（2）化學方法

某些化學（如聚乙二醇PEG）可造成膜脂分子排列的改變，去掉作用因素之后，質(zhì)膜恢復原有的有序結(jié)構(gòu)，在恢復過程中便可誘導相接觸的細胞發(fā)生融合。

其優(yōu)點為：用法簡單，容易獲得融合體，融合效果好，但是也存在對細胞損傷及殘存毒性的缺點。

（3）物理方法

主要包括：電融合法、激光融合法、基于微流控芯片的細胞融合技術(shù)、高通量細胞融合技術(shù)、空間細胞融合技術(shù)、離子束細胞融合技術(shù)、非對稱細胞融合技術(shù)。

其優(yōu)點為操作簡單，對細胞無毒，可在顯微鏡下觀察融合過程等，但是該過程對細胞損傷較大。

6．FDA、DAPI、Cochicine（秋水仙素）等試劑在細胞生物學研究中的主要用途有哪些？簡述其原理。[武漢大學2004研]

答：FDA是一種熒光染料，用來檢驗細胞的死活，活細胞可保留該成分發(fā)出黃綠色熒光，死細胞無這種現(xiàn)象。

DAPI是一種DNA染色劑，其原理是插入到DNA雙螺旋中。DAPI染色可以染細胞核，觀察細胞核形態(tài)的變化。

秋水仙素可用于獲得同步化細胞，或誘導多倍體形成，它是一種微管合成阻斷劑，使細胞停留在M期。

六、論述題

1．在細胞生物學的研究中，實驗材料的選擇具有重要作用。請以紅細胞、線蟲、酵母為例，說明這三種細胞（生物）對細胞生物學研究的貢獻。[中山大學2017研]

答：①紅細胞：紅細胞負責把O₂從肺運送到體內(nèi)各組織，同時把細胞代謝產(chǎn)生的CO₂運回肺中。哺乳動物成熟的紅細胞沒有細胞核和內(nèi)膜系統(tǒng)，所以紅細胞的質(zhì)膜是最簡單最易研究的生物膜。正常情況下，紅細胞呈雙凹形的橢球結(jié)構(gòu)，直徑約7μm，但它可以通過直徑比自己更小的毛細血管。在其平均壽命約120天的期間內(nèi)，人的紅細胞往返于動脈和靜脈達幾百萬次，行程約480km而不破損，這就需要紅細胞質(zhì)膜既有很好的彈性又具有較高的強度。紅細胞質(zhì)膜的這些特性在很大程度上是由膜骨架賦予的。紅細胞的質(zhì)膜與膜骨架比較容易純化、分析。當細胞經(jīng)低滲處理后，質(zhì)膜破裂，同時釋放出血紅蛋白和胞內(nèi)其他可溶性蛋白。這時紅細胞仍然保持原來的基本形狀和大小，這種結(jié)構(gòu)稱為血影。因此紅細胞為研究質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)及其與膜骨架的關(guān)系提供了理想的材料。

②線蟲：在實驗室常用的是秀麗隱桿線蟲，它的基因組序列也已經(jīng)測定完成，全長為9.7×104kb，大約編碼19000個基因。線蟲成體長僅1mm左右。由959個體細胞組成。線蟲繁殖快，生命周期僅為3天，在顯微鏡下通體透明，可以追蹤體內(nèi)每一個細胞的形成。胚胎發(fā)育過程中細胞分裂、分化以及細胞的死亡具有高度的程序性，便于對其進行遺傳學分析。基于上述原因，秀麗隱桿線蟲已經(jīng)成為現(xiàn)代發(fā)育生物學、遺傳學、細胞生物學研究的重要模式生物。

③酵母：作為單細胞真核生物的代表，用于生物學研究的酵母主要有芽殖酵母和裂殖酵母兩種。酵母不僅具有與細菌類似的一些優(yōu)點，而且具有真核細胞的組織結(jié)構(gòu)，即有細胞核和各種細胞器。它是一個非常簡單的單細胞真核生物，生長迅速并且易于遺傳操作。芽殖酵母（單倍體）含有16條線性的染色體，其基因組全長為l.2×104kb，具有約6000個閱讀框。裂殖酵母的基因組大小與芽殖酵母相近，但僅分布在3條染色體上，編碼約4800個蛋白質(zhì)。酵母染色體的結(jié)構(gòu)與所有的真核生物一樣具有自主復制序列，著絲點序列和端粒序列。利用這3個結(jié)構(gòu)元件可以構(gòu)建酵母人工染色體用于大片段DNA序列的克隆和分析。20世紀60年代以來，酵母遺傳學家利用溫度敏感突變技術(shù)篩選并分析了200多個與細胞分裂及周期調(diào)控相關(guān)的基因，從而為揭示細胞周期調(diào)控的分子打下基礎(chǔ)。不僅如此，作為模式生物，酵母基因突變庫也為諸如蛋白質(zhì)相互作用、基因表達調(diào)控、膜泡運輸、細胞分化和衰老等研究領(lǐng)域提供了非常重要的研究材料。

2．試述實驗鑒定細胞壁、細胞核、淀粉粒、油脂和蛋白質(zhì)等細胞結(jié)構(gòu)與組分的方法。[廈門大學2011研]

答：（1）細胞壁的鑒定方法

利用細胞壁質(zhì)壁分離實驗觀察并鑒定細胞壁，實驗原理為：當外界溶液濃度大于細胞液濃度時，根據(jù)擴散作用原理，水分會由細胞液中滲出到外界溶液中，通過滲透作用失水；由于細胞壁和原生質(zhì)層的伸縮性不同，細胞壁伸縮性較小，而原生質(zhì)層較大，從而使二者分開。

（2）細胞核的鑒定方法

由于細胞內(nèi)各種結(jié)構(gòu)的比重和大小都不相同，可用差速離心法分離細胞器：用低滲勻漿、超聲破碎或者研磨等方法使細胞質(zhì)膜破碎，形成細胞核、線粒體、葉綠體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、溶酶體等細胞器和細胞組分的混合勻漿。在密度均一的介質(zhì)中由低速到高速逐級離心，用于分離不同大小的細胞和細胞器。在差速離心中細胞器沉降順序依次為：細胞核、線粒體、溶酶體與過氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高爾基體、最后為核蛋白。利用甲基綠-派洛寧染色液對細胞核染色后可以發(fā)現(xiàn)其被染成藍綠色，核仁和細胞碎片被染成淡紅色。

（3）細胞內(nèi)淀粉粒、油脂和蛋白質(zhì)的鑒定方法

①多糖可用PAS反應鑒定。其原理是過碘酸氧化多糖的1，2-乙二醇基形成醛基后，再利用希夫試劑與醛基反應。因為多糖類物質(zhì)都能產(chǎn)生PAS反應，所以可用不同方式改進其反應特異性。

②四氧化鋨與不飽和脂肪酸反應呈黑色，用以證明油脂的存在。

③蛋白質(zhì)成分有多種鑒定方法。在米倫（Millon）反應中，氮汞試劑與組織中蛋白質(zhì)側(cè)鏈上的酪氨酸殘基反應，形成紅色沉淀；在重氮反應中，氫氧化重氮與酪氨酸、色氨酸和組氨酸反應形成有色的復合物；蛋白質(zhì)中的-SH基可用形成硫醇鹽共價鍵的試劑進行檢測等。

3．細胞生物學研究成功的關(guān)鍵在于運用模式生物。試舉出三種生物學上常用的模式生物，并逐一說明該模式生物在生物學研究中的用途和優(yōu)勢。[中科院-中科大2009研]

答：常用的模式生物有：

（1）大腸桿菌。大腸桿菌是原核生物的代表，它的基因組信息量少而全，是研究原核生物的良好模式生物。除此之外，大腸桿菌還是良好的生物學研究工具，例如人們常用工程改良的大腸桿菌來大量擴增質(zhì)粒和表達蛋白等等。

（2）果蠅。果蠅是昆蟲的代表。果蠅作為模式生物的優(yōu)勢在于其基因組信息全面，而且現(xiàn)有全面的針對果蠅的系統(tǒng)研究工具，全世界積累了大量果蠅品系，這些都對果蠅研究提供了便利。常用果蠅來進行基因和遺傳研究。

（3）小鼠。小鼠是哺乳動物的模式生物，與人的親緣關(guān)系在各種模式生物中最近，因而也備受關(guān)注。但是因為其復雜性和較長的生長繁殖周期使得很多實驗不能像在其他低等模式生物中那樣快速展開并得到良好的結(jié)果，因此在小鼠身上的實驗一般放在最后，在得到初步結(jié)果后再到小鼠身上驗證。

4．在基因敲除試驗中，需要進行外源基因的轉(zhuǎn)移，請說明為什么要用胚胎干細胞作為受體？請你展望胚胎干細胞培養(yǎng)的應用前景。[北京師范大學2006研]

答：（1）用胚胎干細胞作為受體的原因

胚胎干細胞（ES）來源于正常的二倍體胚胎細胞，具有完整的核型，形成嵌合體動物的效率高，且可在體外長期培養(yǎng)，只要條件適宜，細胞可只分裂而不分化地連續(xù)傳代，且保持多能性。自20世紀80年代末發(fā)明基因敲除技術(shù)以來，ES細胞已成為制作嵌合體、獲取轉(zhuǎn)基因動物的一種重要途徑。這是因為它具有很多獨特的優(yōu)點：

①ES細胞具有多能性，而且可以在體外培養(yǎng)和傳代，這樣就可以按照人們的意愿對其進行一定的操作，如外源基因的轉(zhuǎn)化、克隆、增殖、凍存和顯微操作等。實驗證明，ES細胞注射到囊胚腔震。可參與宿主胚胎的發(fā)育形成正常的胚胎，不僅形成嵌合體的效率高和具有分化出各種組織的潛能，而且能形成有功能的生殖細胞。

②ES細胞在不同的生長條件下具有不同的功能狀態(tài)，如在滋養(yǎng)層細胞上，ES細胞呈未分化狀態(tài)；在沒有滋養(yǎng)層條件下經(jīng)過誘導，ES細胞可分化成多種細胞、甚至胚狀體。所以，它可用于細胞分化、組織發(fā)生以及基因表達與調(diào)控研究等方面的生物學研究。

（2）胚胎干細胞培養(yǎng)的應用前景

①在遺傳工程方面，除了可用于制作嵌合體動物、進行遺傳學研究外，還可以用作轉(zhuǎn)基因動物的載體。②在基礎(chǔ)理論研究中，則可以用于演示細胞分化、組織發(fā)生、癌變機制、基因表達、基因敲除和基因定位整合等。③近年來，ES細胞用于某些疾病臨床治療的研究也取得了可喜的勢頭，在未來的研究中，無論在基礎(chǔ)理論研究還是生物技術(shù)方面，ES細胞都將成為重要的材料和工具。