第3章　氨基酸

3.1　復習筆記

一、氨基酸

1蛋白質(zhì)的水解

蛋白質(zhì)能夠被酸、堿或蛋白酶催化水解。根據(jù)蛋白質(zhì)的水解程度不同，可分為完全水解和部分水解兩種情況，水解產(chǎn)物得到的是各種氨基酸的混合物。如表3-1所示是蛋白質(zhì)水解的幾種方法。

表3-1　水解蛋白質(zhì)的方法

2α-氨基酸的一般結(jié)構(gòu)

（1）氨基酸是既含氨基又含羧基的有機化合物，常見的氨基酸有20種，除脯氨酸是亞氨基酸外，其余都是α-氨基酸。

（2）α-氨基酸是指羧酸分子中α-碳原子上的一個氫原子被氨基取代而成的化合物，不同氨基酸之間結(jié)構(gòu)的差異都由側(cè)鏈基團R表現(xiàn)。

（3）氨基酸能以首尾相連的方式進行聚合反應，除去一分子水形成共價酰胺鍵，又稱肽鍵。

（4）除甘氨酸外，其他的α-碳原子都是手性碳原子，因此都具有旋光性，且都為L型。

（5）除胱氨酸和酪氨酸外，一般都能溶于水；脯氨酸和羥脯氨酸還能溶于乙醇或乙醚中。

二、氨基酸的分類

為方便表達蛋白質(zhì)或多肽的結(jié)構(gòu)需要，氨基酸的名稱常用三個字母的簡寫符號表示，有時候也用單字母的簡寫符號表示（表3-2）。

表3-2　氨基酸的簡寫符號

1常見的蛋白質(zhì)氨基酸

常見的20種氨基酸根據(jù)側(cè)鏈基團（—R）的化學結(jié)構(gòu)可分為脂肪族、芳香族和雜環(huán)族（圖3-1）；根據(jù)側(cè)鏈基團的極性又可分為非極性氨基酸、不帶電荷的極性氨基酸、帶正電荷氨基酸和帶負電荷氨基酸（圖3-1）。

圖3-1　氨基酸的分類

2不常見的蛋白質(zhì)氨基酸

由相應的常見氨基酸經(jīng)修飾（磷酸化、羥化、羧化、甲基化等）而來的，例如5-羥賴氨酸、4-羥脯氨酸、3-甲基組氨酸、γ-羧基谷氨酸等等。

3非蛋白質(zhì)氨基酸

非蛋白質(zhì)氨基酸不參與蛋白的組成，多是重要的代謝物前體或代謝中間物，它們不是蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)單元，但在生物體內(nèi)具有很多生物學功能。

（1）L-型α-氨基酸的衍生物：尿素循環(huán)中的L-瓜氨酸和L-鳥氨酸。

（2）D-型氨基酸：D-Glu，D-Ala（存在于肽聚糖中），D-Phe（存在于短桿菌肽S中）。

（3）β-氨基酸、γ-氨基酸、δ-氨基酸：β-Ala（泛素的前體）、γ-氨基丁酸（神經(jīng)遞質(zhì)）。

三、氨基酸的酸堿化學

1氨基酸的兼性離子形式

氨基酸在晶體或水中主要是以兼性離子（偶極離子）的形式存在。氨基酸在水中的兼性離子既起著酸（質(zhì)子供體）的作用，也起堿（質(zhì)子受體）的作用，因此它為兩性電解質(zhì)。

2氨基酸的解離

（1）氨基酸解離步驟

氨基酸是一類兩性電解質(zhì)，其解離情況可用滴定測得，以甘氨酸為例，它是一個二元酸，它的分步解離步驟如下：

第一步解離（1）

第二步解離（2）

式中K_a1和K_a2分別表示甘氨酸羧基和氨基的解離常數(shù)。一般，共輒酸的解離常數(shù)按其酸性遞降順序編號為 K_a1，K_a2等。

（2）甘氨酸的滴定曲線（圖3-2）

①滴定時，以加入的氫氧化鈉的摩爾數(shù)對pH作圖，則得滴定曲線B段，在pH9.60處有一個拐點。從甘氨酸的解離公式（2）可知，當?shù)味ㄖ粮拾彼岬募嫘噪x子有一半變成陰離子，即[A0]＝[A－]時，則K_a2＝[H＋]，兩邊各取對數(shù)得pK_a2＝pH，這就是曲線B段拐點處的pH9.60。

②如果用標準鹽酸滴定，以加入的鹽酸的摩爾數(shù)對pH作圖，則得滴定曲線A段，在pH2.34處有一個拐點。從解離公式（1）可知，pK_a1＝2.34，這里甘氨酸的等電兼性離子和陽離子的摩爾數(shù)相等，即[A0]＝[A＋]。根據(jù)

就可求得甘氨酸在溶液中的解離情況。

圖3-2　甘氨酸的滴定曲線（解離曲線）

（3）注意事項

①20種基本氨基酸只有組氨酸在生理pH下有明顯的緩沖容量，因為其他氨基酸的pK值都不在pH7附近；

②R基團不解離的氨基酸pK_a1范圍2.0～3.0，pK_a2為9.0～10.0。

表3-3　20種氨基酸的解離常數(shù)和等電點

3氨基酸的等電點（PI）

氨基酸的帶電狀況與溶液的pH有關(guān)，氨基酸的等電點是指當溶液的pH使氨基酸帶的正負電荷一樣（凈電荷為零）的時候，這時候氨基酸在電場中既不向正極也不向負極移動，即處于等電兼性離子狀態(tài)時的溶液的pH。

（1）等電點的計算方法

①對側(cè)鏈R基不解離的中性氨基酸而言，其等電點是它的pK_a1和pK_a2的算術(shù)平均值：

注意：pI值與該離子濃度基本無關(guān)，只決定于等電兼性離子兩側(cè)的pK_a值。

②對側(cè)鏈R基是解離的酸性氨基酸而言，其等電點是它兩個羧基pK_a的平均值。

③對側(cè)鏈R基是解離的堿性氨基酸而言，其等電點是它兩個氨基pK_a的平均值。

（2）氨基酸的帶電狀況與pH的關(guān)系

①在等電點以上的任一pH，氨基酸帶凈負電荷，在電場中將向正極移動。

②在低于等電點的任一pH，氨基酸帶有凈正電荷，在電場中將向負極移動。

③在一定pH范圍內(nèi)，氨基酸溶液的pH離等電點愈遠，氨基酸所攜帶的凈電荷愈大。

4氨基酸的甲醛滴定

氨基酸是兩性電解質(zhì)，不能直接用酸堿滴定來進行定量測定，是因為氨基酸的酸、堿滴定的等電點pH或過高或過低，沒有適當?shù)闹甘緞┛杀贿x用，所以選用甲醛來進行滴定。

（1）原理

向氨基酸溶液中加入過量的甲醛，用標準氫氧化鈉滴定時，由于甲醛與氨基酸中的—NH₂作用形成羥甲基衍生物而降低了氨基的堿性，相對地增強了—NH₃的酸性解離，降低了氨基的堿性。

（2）滴定結(jié)果

甲醛滴定法的結(jié)果是當氨基酸溶液中存在1mol/L甲醛時，滴定終點由pH12左右移至pH9附近，剛好達到酚酞指示劑的變色區(qū)域。

四、氨基酸的化學反應

氨基酸的化學反應主要是指它的α-氨基和α-羧基以及側(cè)鏈上的功能團所參與的反應，如表3-4所示。

表3-4　氨基酸的化學反應

五、氨基酸的光學活性和光譜性質(zhì)

1氨基酸的旋光性

（1）氨基酸的構(gòu)型

氨基酸由兩種構(gòu)型，即D型和L型。除甘氨酸外，其余的蛋白質(zhì)氨基酸均有手性，且具有旋光性，為L型。

（2）旋光性

①外消旋物：是指旋光性物質(zhì)在化學反應中，只要其不對稱原子經(jīng)過對稱狀態(tài)的中間階段，便將發(fā)生消旋作用并轉(zhuǎn)變?yōu)镈型和L型的等摩爾混合物。

②內(nèi)消旋物：是指分子內(nèi)消旋的現(xiàn)象。

（3）蛋白質(zhì)中L型氨基酸的比旋光度

氨基酸的旋光符號和大小取決于它的R基性質(zhì)，并且與測定的溶液pH有關(guān)，因為在不同的pH條件下氨基和羧基的解離狀態(tài)不同。

2氨基酸的光譜性質(zhì)

參與蛋白質(zhì)組成的20多種氨基酸在可見光區(qū)都沒有光吸收，在紅外區(qū)和遠紫外區(qū)（λ＜200nm）都有光吸收，在近紫外區(qū)（200～400nm）只有芳香族氨基酸有吸收光的能力，因為它們的R基含有苯環(huán)共軛π鍵系統(tǒng)。

（1）酪氨酸的最大光吸收波長（λ_max）在275nm；

（2）苯丙氨酸λ_max＝257nm；

（3）色氨酸的λ_max＝280nm。

六、氨基酸混合物的分析分離

1分配層析法的一般原理

層析又稱色層分析或色譜。層析系統(tǒng)通常由固定相或靜相兩個系統(tǒng)組成。混合物在層析系統(tǒng)中的分離決定于該混合物的組分在這兩相中的分配情況，一般用分配系數(shù)K_d來描述，即一種溶質(zhì)在兩種給定的互不相溶的溶劑中分配時，在一定溫度下達到平衡后，溶質(zhì)在兩相中的濃度比值。待分離的物質(zhì)由于彼此分配系數(shù)的不同，經(jīng)過分配層析后最終分離開來。使用層析法分離氨基酸混合物時，先決條件是各種氨基酸成分的分配系數(shù)要有差異，分配系數(shù)越大越容易分開。

2分配柱層析

層析柱中的填充物（又稱支持劑）都是一些具有親水性的不溶物質(zhì)，可以看作為固定相。沿固定相流過的與它不互溶的溶劑是流動相。當流動相移動時，加在柱上端的氨基酸混合物樣品在兩相之間將發(fā)生連續(xù)分配，混合物中具有不同分配系數(shù)的各種成分沿分配柱以不同的速度向下移動，收集出的氨基酸分別用茚三酮顯色定量。以氨基酸量對洗出液體積作圖，得洗脫曲線，曲線中的每個峰相當于某一種氨基酸。

3紙層析

紙層析的濾紙纖維素上吸附的水是固定相，展層用的溶劑是流動相。層析時，利用極性和非極性氨基酸在水（固定相）和有機溶劑（流動相）中溶解度的不同，所以各種氨基酸在兩個溶劑系統(tǒng)中具有不同的R_f值，它們分布在濾紙的不同位置上，在濾紙上進行分離。當用茚三酮溶液顯色時可得到一個雙向紙層析譜。

4薄層層析

薄層層析是把支持劑涂布在玻璃板上使成一個均勻的薄層，把要分析的樣品滴加在薄層的一端，然后用合適的溶劑在密閉的容器中進行展層，使樣品中各個成分分離開來，最后進行鑒定和定量測定。

5離子交換層析

離子交換層析利用離子交換劑上的活性基團和周圍溶液中的離子進行交換時各種離子交換能力和洗脫時各種順序的不同來達到分離的目的。交換樹脂可分為陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂兩大類。陽離子交換樹脂含有的酸性基團可解離出H＋離子，當溶液中含有其他陽離子時，例如在酸性環(huán)境中的氨基酸陽離子可以和H＋發(fā)生交換而結(jié)合在樹脂上，此時氨基酸與陽離子交換樹脂之間的靜電吸引力大小是堿性氨基酸（A2＋）＞中性氨基酸（A＋）＞酸性氨基酸（A0）因此各個氨基酸的洗脫順序為酸性氨基酸，中性氨基酸，堿性氨基酸。

6氣液層析

氣液層析又稱氣液色譜或氣相層析，是指當層析系統(tǒng)的流動相為氣體，固定相為涂漬在固體顆粒表面的液體的層析技術(shù)。利用氣相層析法進行分離是基于分配過程，即利用樣品組分在流動的氣相和固定在顆粒表面的液相中的分配系數(shù)不同達到分離組分的目的。

7高效液相層析

高效液相層析簡稱HPLC，是具有快速、靈敏、高效的優(yōu)點的分離技術(shù)。HPLC的特點是：使用的固定相支持劑顆粒很細，因而比表面積很大；溶劑系統(tǒng)采取高壓，因此洗脫速度增大。