第23章　檸檬酸循環

23.1　復習筆記

一、丙酮酸進入檸檬酸循環的準備階段—形成乙酰-CoA

1．丙酮酸轉變為乙酰CoA

（1）總反應式

（2）丙酮酸脫氫酶

丙酮酸脫氫酶是一個復合酶，其組成如表23-1所示。

表23-1  丙酮酸脫羧酶復合體的組成

2．催化丙酮酸轉變為乙酰-CoA的反應步驟

（1）丙酮酸脫羧反應

①該反應由丙酮酸脫氫酶組分E₁催化。該酶以TPP為輔基。它催化的反應式為

②丙酮酸脫氫酶組分的催化反應步驟

a．發生在TPP輔基的催化反應，形成羥乙基-TPP-E₁；

b．羥乙基氧化形成乙酰基。

（2）形成乙酰-CoA

由二氫硫辛酰轉乙酰基酶催化，將其結合的乙酰基轉移到CoA-SH分子上，形成游離的乙酰-CoA分子，從而使二氫硫辛酰轉乙酰基酶成為還原型的二氫硫辛酰轉乙酰基酶。這是一個酯基轉移反應。

（3）還原型二氫硫辛酰轉乙酰基酶氧化，形成氧化型的（二氫）硫辛酰轉乙酰基酶

①這一步反應是使氧化型硫辛酰胺再生的反應。

②氧化型的NAD＋起著氧化劑的作用，催化此反應的酶稱為二氫硫辛酸脫氫，簡稱E₃，又稱二氫硫辛酰胺脫氫酶，該酶的輔基是FAD。二氫硫辛酸脫氫酶使二氫硫辛酰胺再氧化，從而使其完成了它的全部反應過程。

（4）還原型的E₃再氧化

還原型E₃二硫鍵的再氧化先由該酶結合著的輔基FAD接受-SH基的氫原子，形成FADH₂，接著又將氫原子轉移給NAD＋，于是恢復其氧化型。

3．丙酮酸脫氫酶復合體催化反應的簡單圖解

丙酮酸脫氫酶復合體中的三種酶，它的輔助因子有輔酶A、NAD＋、TPP、硫辛酰胺和FAD，丙酮酸脫羧形成乙酰-CoA的復雜過程可用簡單的圖解如圖23-1所示。

圖23-1  丙酮酸脫氫酶復合體催化反應圖解

4．砷化物對硫辛酰胺的毒害作用

（1）砷化物對機體的毒害不僅限于對糖酵解的抑制作用。

（2）砷化物的毒害作用機制是與丙酮酸脫氫酶復合體中的E₂輔基硫辛酰胺的巰基發生共價結合，使還原型硫辛酰胺形成失去催化能力的砷化物。這類砷化物抑制丙酮酸脫氫酶復合體的機制同樣表現在對α-酮戊二酸脫氫酶的抑制作用。

5．丙酮酸脫氫酶復合體的調控

（1）產物控制

①由產物NADH和乙酰-CoA控制。

NADH與乙酰-CoA的抑制作用是和酶的作用底物即NAD＋和CoA競爭酶的活性部位，是競爭性抑制。乙酰-CoA抑制E₂，NADH抑制E₃。

②[NADH]/[NAD＋]和[乙酰-CoA]/[CoA]的比值

當[NADH]/[NAD＋]和[乙酰-CoA]/[CoA]的比值高時，E₂處于與乙酰基結合的形式而不能接受在E₁酶上與TPP結合著的羥乙基基團，使E₁酶上的TPP停留在與羥乙基結合的狀態，從而抑制了丙酮酸脫羧作用的進行。

（2）磷酸化和去磷酸化的調控

在處于丙酮酸脫氫酶復合體核心位置的E₂分子上結合著激酶和磷酸酶。

①激酶使丙酮酸脫氫酶組分磷酸化，磷酸酶則是脫去丙酮酸脫氫酶的磷酸基團從而使丙酮酸脫氫酶復合體活化。

②Ca2＋通過激活磷酸酶的作用，也使丙酮酸脫氫酶活化。

二、檸檬酸循環概貌

1．檸檬酸循環是在細胞的線粒體中進行的。

2．檸檬酸循環的起始步驟可看作是由4個碳原子的化合物與循環外的兩個碳原子的化合物形成6個碳原子的檸檬酸，檸檬酸經過異構、氧化、脫羧、氧化脫羧和三次轉化最后又形成4個碳原子的草酰乙酸。即：

完成一次循環

圖23-2  檸檬酸循環概貌示意圖

三、檸檬酸循環的反應機制

1．草酰乙酸與乙酰-CoA縮合形成檸檬酸

（1）總反應式

這是檸檬酸循環的起始步驟，含有兩個碳原子的化合物以乙酰-CoA形式進入檸檬酸循環。以硫酯形式進入的乙酸含有足夠的能量，使反應能順利進行。

（2）檸檬酸合酶

①檸檬酸合酶催化上述反應，它是檸檬酸循環中的限速酶；

②檸檬酸合酶屬于調控酶。活性受ATP、NADH、琥珀酰-CoA、酯酰-CoA等的抑制；

③檸檬酸合酶是由兩個亞基構成的二聚體，其中含有一個草酰乙酸結合位點。由草酰乙酸與酶結合后而誘導出的構象變化，產生了乙酰-CoA的結合部位并且杜絕了溶劑對草酰乙酸的干擾。這是一個典型的由于底物與酶結合而誘導產生的誘導楔合模型。

（3）檸檬酸合酶催化反應的機制

檸檬酸合酶催化的反應屬于醛醇-克萊森酯縮合反應，它的反應可劃分為3步，如圖23-3所示。

圖23-3  檸檬酸合酶催化的縮合反應

（4）檸檬酸合酶的抑制劑

①氟乙酰-CoA

a．由氟乙酸形成的氟乙酰-CoA可被檸檬酸合酶催化與草酰乙酸縮合生成氟檸檬酸。它取代檸檬酸結合到順-烏頭酸酶的活性部位上，從而抑制檸檬酸循環的下一步反應。

b．由氟乙酰-CoA形成氟檸檬酸的反應稱為致死性合成反應。這一特性可用于制造殺蟲劑或滅鼠藥。

②丙酮基-CoA

丙酮基-CoA是乙酰-CoA的類似物，可對乙酰-CoA的反應產生抑制效應，因可代替乙酰-CoA與檸檬酸合酶結合。

2．檸檬酸異構化形成異檸檬酸

（1）反應式

（2）異檸檬酸酶

①異檸檬酸的酶又稱烏頭酸酶，能催化檸檬酸和異檸檬酸互變的雙向反應，沒有旋光性但有手性。

②烏頭酸酶含有由共價鍵結合的4個Fe2＋。這4個Fe2＋和4個無機硫化物、4個半胱氨酸的硫原子一起結合成團，稱為Fe-S聚簇。Fe-S聚簇與檸檬酸結合，并參與底物的脫水和再水合作用。

3．異檸檬酸氧化形成α-酮戊二酸

（1）反應式

異檸檬酸氧化脫羧是一個氧化-還原步驟，也是檸檬酸循環中兩次氧化脫羧反應中的第一個反應。氧化的中間產物是草酰琥珀酸。

（2）異檸檬酸脫氫酶

異檸檬酸脫氫酶在高等動植物以及大多數微生物中有兩種。

①以NAD＋為輔酶，只存在于線粒體中，需要有Mg2＋或Mn2＋激活；

②以NADP＋為輔酶。既存在于線粒體中也存在于細胞溶膠中。

（3）β-裂解

由β-羥酸氧化為β-酮酸，從而引起脫羧反應，也就是促進了相鄰C-C鍵的斷裂，稱為β-裂解。這種β-裂解是生物化學中最常見的一種C-C鍵的斷裂方式。

（4）異檸檬酸脫氫的生物學意義

通過這一步反應，使生物體解決了具有兩個碳原子的乙酰基氧化和降解的問題。

（5）異檸檬酸脫氫酶的調節

①異檸檬酸脫氫酶是一個變構調節酶。它的活性受ADP變構激活。ADP可增強酶與底物的親和力；

②該酶與異檸檬酸、Mg2＋、NAD＋、ADP的結合有相互協同作用；

③NADH、ATP對異檸檬酸脫氫酶起變構抑制作用。在能荷低的情況下NAD＋的含量升高，這有利于檸檬酸脫氫酶，對其他需要以NAD＋為輔助因子的酶促反應也有推動作用。

（6）異檸檬酸酶的磷酸化和脫磷酸化

①細菌中的異檸檬酸脫氫酶受磷酸化的抑制。在酶活性部位的絲氨酸被磷酸化，則會抑制酶與異檸檬酸底物的結合。

②使異檸檬酸脫氫酶磷酸化的酶稱為異檸檬酸脫氫酶激酶，使磷酸化了的異檸檬酸脫氫酶脫去磷酸的酶稱為異檸檬酸脫氫酶磷酸酶。這兩種不同作用的酶處于同一條肽鏈上。

4．α-酮戊二酸氧化脫羧形成琥珀酰-CoA

（1）反應式

這是檸檬酸循環中的第二次脫羧。該反應需要NAD＋和CoA作為輔助因子。

（2）α-酮戊二酸氧化釋放出的能量的作用

①驅使NAD＋還原；

②促使反應向氧化方向進行并大量放能；

③相當的能量以琥珀酰CoA的高能硫酯鍵形式保存起來。

（3）α-酮戊二酸脫氫酶

①α-酮戊二酸脫氫酶是一個多酶復合體，由α-酮戊二酸脫氫酶（E₁）、二氫硫辛酰轉琥珀酰酶（E₂）、二氫硫辛酰脫氫酶（E₃）組成；

②反應需要TPP、硫辛酸、CoA、FAD、NAD＋、Mg2＋6種輔助因子。

（4）α-酮戊二酸脫氫酶的調節

①α-酮戊二酸脫氫酶是一個變構調節酶，受其產物琥珀酰-CoA和NADH的抑制，也受高能荷的抑制；

②α-酮戊二酸脫氫酶不受磷酸化、去磷酸化共價修飾的調節。

5．琥珀酰-CoA轉化成琥珀酸

（1）反應式

這是檸檬酸循環中唯一直接產生一個高能磷酸鍵的步驟。

（2）琥珀酰-CoA合成酶

琥珀酰-CoA合成酶又稱琥珀酰硫激酶，催化的反應產生一個高能磷酸鍵；在哺乳動物形成一分子GTP，在植物和微生物直接形成ATP。

（3）GTP在生物合成中的作用

①GTP在蛋白質的生物合成中是磷酰基供體，參與信號的傳遞過程；

②GTP在核苷二磷酸激酶的催化下將磷酰基轉給ADP生成ATP。

6．琥珀酸脫氫形成延胡索酸

（1）反應式

（2）琥珀酸脫氫酶

①琥珀酸脫氫酶是唯一嵌入到線粒體內膜的酶，而其他的酶大多存在于線粒體的基質；

②以FAD作為其脫下電子的受體，琥珀酸脫氫酶與FAD是以共價鍵互相連接，因此是酶和輔基的關系。，而且這個輔基是一種修飾形式；

③琥珀酸脫氫酶催化的是碳-碳鍵的氧化；

④琥珀酸脫氫酶催化琥珀酸的脫氫具有嚴格的立體專一性。

（3）琥珀酸脫氫酶的調節

丙二酸與琥珀酸脫氫酶的底物在結構上相類似，其可以與琥珀酸脫氫酶結合，但琥珀酸脫氫酶卻不能催化其脫氫，因此丙二酸是琥珀酸脫氫酶的強抑制劑，能抑制細胞呼吸。

（4）琥珀酸脫氫酶中的鐵硫聚簇

①琥珀酸脫氫酶中含有三種不同的鐵硫聚簇：

a．一種是兩個鐵原子結合到兩個無機硫化物上，用2Fe-2S表示；

b．另外兩種是3個鐵原子和4個鐵原子結合到4個無機硫化物上，用3Fe-4S和4Fe-4S表示。

②琥珀酸脫氫酶是直接連在電子傳遞鏈上的，由琥珀酸分子上脫下的氫即形成FADH₂，后者直接將電子傳遞給酶分子的Fe-S。在氧化磷酸化的電子傳遞反應中以及在光合作用中都起著重要的作用。

7．延胡索酸水合形成L-蘋果酸

（1）反應式

（2）延胡索酸酶

催化延胡索酸水合形成蘋果酸的酶稱為延胡索酸酶。該酶的催化反應具有嚴格的立體專一性質，只能形成L-蘋果酸。

8．L-蘋果酸脫氫形成草酰乙酸

（1）蘋果酸脫氫酶

L-蘋果酸的羥基氧化形成羰基，催化這個反應的酶稱為蘋果酸脫氫酶。它的輔酶是NAD＋。

（2）所有已知的脫氫酶的共同性質

①具有立體結構的專一性；

②都以NAD＋作為電子受體；

③NAD＋的腺嘌呤核苷部分都是結合在酶的疏水裂縫中；

④煙酰胺與酶結合是使其發揮活性作用的部分暴露在極性環境中，不發揮活性的其他部分還是與酶的疏水基團相接；

⑤與酶結合的NAD＋分子呈現伸展的構象形式。

四、檸檬酸循環的化學總結算

1．檸檬酸循環的總化學反應式

2．檸檬酸循環中的能量計算

表23-2  檸檬酸循環中產生的ATP

表23-3  檸檬酸循環的總結算

五、檸檬酸循環的調控

1．檸檬酸循環本身制約系統的調節

（1）酶的調控

檸檬酸循環中檸檬酸合酶、異檸檬酸脫氫酶和α-酮戊二酸脫氫酶是反應的關鍵酶。

23-4  檸檬酸循環的酶調控

（2）底物的調控

檸檬酸循環中酶的活性主要靠底物提供的情況推動，并受其生成產物濃度的抑制。循環中最關鍵的底物為乙酰-CoA、草酰乙酸和產物NADH。

2．ATP、ADP和Ca2＋對檸檬酸循環的調節

（1）ATP和ADP

ADP是異檸檬酸脫氫酶的變構促進劑，從而增加了該酶對底物的親和力。機體活動處于靜息狀態時，ATP的消耗下降、濃度上升，對異檸檬酸脫氫酶產生抑制效應。

（2）Ca2＋

Ca2＋刺激糖原的降解、啟動肌肉收縮，還對許多激素的信號起中介作用，在檸檬酸循環中對丙酮酸脫氫酶磷酸酶、異檸檬酸脫氫酶和α-酮戊二酸脫氫酶都有激活作用。

圖23-4  乙酰-CoA形成和檸檬酸循環中的激活和抑制部位示意圖

圖中表示ADP和Ca2＋為激動劑，NADH、ATP為抑制劑

六、檸檬酸循環的雙重作用

檸檬酸循環是絕大多數生物體主要的分解代謝途徑，也是準備提供大量自由能的重要代謝系統，在許多合成代謝中都利用檸檬酸循環的中間產物作為生物合成的前體來源，因此，檸檬酸循環具有分解代謝和合成代謝雙重性或稱兩用性（如圖23-5）。

圖23-5  檸檬酸循環的雙重作用