5.2　熒光與分子結(jié)構(gòu)的關系

5.2.1　熒光效率和熒光壽命

能產(chǎn)生熒光的分子稱為熒光分子。能產(chǎn)生熒光的分子必須具備的條件包括：

①具有合適的結(jié)構(gòu)　熒光分子通常為有強紫外-可見吸收的苯環(huán)或稠環(huán)結(jié)構(gòu)的有機分子，如熒光素、聯(lián)苯、芴。

②具備較高的熒光效率　熒光效率又稱熒光產(chǎn)率，是指物質(zhì)分子發(fā)射熒光的光量子數(shù)與吸收激發(fā)光的光量子數(shù)之比，常用?f表示：

　　（5-1）

熒光效率0≤?f≤1。?f =1表示每吸收一個光量子就發(fā)射一個光量子，但大部分熒光物質(zhì)?f<1。例如熒光素鈉在水中?f=0.92；熒光素在水中?f=0.65；蒽在乙醇中?f =0.30；菲在乙醇中?f= 0.10。熒光效率越低說明該物質(zhì)雖然有較強的紫外吸收，但所吸收的能量多以無輻射躍遷形式釋放，所以熒光強度弱。

熒光壽命指激發(fā)光除去后，分子熒光強度降至最大熒光強度的1/e所需的時間，常用τf表示。物質(zhì)被激發(fā)時的熒光強度（F0）和除去激發(fā)后t時間的熒光強度（Ft）呈指數(shù)關系，具體見式（5-2）：

Ft=F0e-kt　　 （5-2）

式中，k為衰減常數(shù)。當時，t=τf，代入式（5-2）得：

　　（5-3）

將式（5-3）代入式（5-2）得：

　　（5-4）

以ln對t作圖，斜率的倒數(shù)為熒光壽命。利用分子熒光壽命的不同，可進行混合熒光物質(zhì)的分析。

5.2.2　熒光強度與結(jié)構(gòu)的關系

物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)不僅與是否有熒光的發(fā)生有關，還與熒光強度密切相關，因此可以根據(jù)物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)判斷其熒光特性。化學結(jié)構(gòu)與熒光強度之間的規(guī)律如下：

（1）躍遷類型

分子結(jié)構(gòu)中具有π→π*躍遷或n→π*躍遷的物質(zhì)都有紫外-可見吸收，但n→π*躍遷引起的R帶是一個弱吸收帶，電子躍遷概率小，由此產(chǎn)生的熒光極弱。發(fā)生π→π*躍遷的分子其摩爾吸光系數(shù)比n→π*躍遷大100～1000倍，激發(fā)單線態(tài)與三線態(tài)間能量差別比n→π*躍遷大很多，電子不易自旋反轉(zhuǎn)，體系間跨越概率小，因此實際上分子結(jié)構(gòu)中存在共軛的π→π*躍遷的分子熒光效率高，強度大。

（2）共軛效應

絕大多數(shù)能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)都含有芳香環(huán)或雜環(huán)，因為芳香環(huán)或雜環(huán)分子具有長共軛（π→π*）體系。共軛體系越長，熒光強度（熒光效率）越大，其和產(chǎn)生紅移。如苯、萘、蒽三個化合物的共軛結(jié)構(gòu)與熒光的關系如下：　

　　對共軛環(huán)數(shù)相同的芳香族化合物，線性環(huán)結(jié)構(gòu)的熒光波長比非線性的要長。如菲和蒽共軛環(huán)數(shù)相同，菲為角形結(jié)構(gòu)，為350nm。

含有長共軛雙鍵的脂肪烴也可能有熒光，但這一類化合物的數(shù)目不多。維生素A是能發(fā)射熒光的脂肪烴之一，結(jié)構(gòu)式如下：

（3）剛性和共平面性效應

熒光分子具有剛性平面結(jié)構(gòu)，可降低分子振動，減少與溶劑相互作用，具有較強的熒光。剛性、共平面性變大，熒光效率增大，熒光波長紅移。如酚酞和熒光素結(jié)構(gòu)相似，熒光素多一個氧橋，使分子的3個環(huán)成一個平面，分子的剛性和共平面性增加，電子的共軛程度增加，因而熒光素有強烈的熒光，但酚酞卻較弱。聯(lián)苯和芴的熒光效率?f分別為0.18和1.0，二者的結(jié)構(gòu)差別在于芴的分子中引入亞甲基成橋，使兩個苯環(huán)不能自由旋轉(zhuǎn)，剛性和共平面性增加，熒光效率大大增加。

熒光素　　　　　　酚酞

本身無熒光或發(fā)生較弱熒光的物質(zhì)，與金屬離子形成絡合物后，若剛性和共平面性增強，則可產(chǎn)生熒光或熒光增強。如弱熒光物質(zhì)8-羥基喹啉與Mg2+形成絡合物熒光強度增強。

（4）取代基效應

芳環(huán)上的各種取代基對分子的熒光光譜和熒光強度都產(chǎn)生很大影響，取代基可分為三類：

①取代基增加分子的π電子共軛程度，使熒光效率提高，熒光波長紅移。取代基包括：—NH2、—OH、—OCH3、—NHR、—NR2、—CN等供電子基。如苯胺、苯酚的熒光強度是苯的50倍。

②取代基減弱分子的π電子共軛體系，使熒光減弱甚至熄滅。取代基包括：—COOH、—NO2、—CO、—NO、—SH、—NHCOCH3、—X等吸電子基。如硝基苯、苯甲酸、溴苯是非熒光物質(zhì)。

③取代基對π電子共軛體系作用較小，對熒光影響不明顯。取代基包括：—R、—SO3H、—N等。

（5）空間位阻效應

取代基空間位阻對熒光強度也有影響。在熒光物質(zhì)分子中引入了較大基團后，由于位阻的原因分子的共平面性下降，則熒光減弱。例如，1-二甲氨基萘-8-磺酸鹽中的二甲氨基與磺酸鹽之間的位阻效應，使分子發(fā)生了扭轉(zhuǎn)，兩個環(huán)不能共平面，因而使熒光大大減弱。

同理，由于立體異構(gòu)造成的空間位阻對熒光強度也有顯著影響。如1，2-二苯乙烯的反式異構(gòu)體有強熒光，而順勢異構(gòu)體沒有熒光。原因是順式分子的兩個基團在同一側(cè)，空間位阻使分子不能共平面而沒有熒光。

5.2.3　影響熒光強度的外界因素

分子所處的外界環(huán)境，如溫度、溶劑、pH值、熒光猝滅劑等都會影響熒光效率，甚至影響分子結(jié)構(gòu)及立體構(gòu)象，從而影響熒光光譜的形狀和強度。

（1）溶劑的影響

溶劑對熒光的影響稱為溶劑效應，是影響熒光光譜形狀、強度、位移的重要因素之一。一般情況下，熒光波長隨著溶劑極性的增大而紅移，熒光強度也有所增強。這是因為極性溶劑使π→π*躍遷所需的能量差降低，躍遷概率增加，從而使紅移，強度增強。同理，增加溶劑的非極性可使藍移。另外溶劑黏度增加可降低溶質(zhì)分子間碰撞概率，無輻射躍遷減少，熒光強度增加。表5-1為8-巰基喹啉在不同溶劑中的熒光峰位及熒光效率。

（2）溫度的影響

隨著溫度的升高，分子運動速度加快，溶劑的弛豫作用減小，熒光物質(zhì)與溶劑分子的碰撞頻率增加，外轉(zhuǎn)換概率增加，熒光效率下降，熒光強度將降低。例如熒光素鈉的乙醇溶液在0℃以下，溫度每降低10℃，?f 增加3%，在-80℃時，?f 為1。

（3）pH值的影響

當熒光物質(zhì)本身是弱酸或弱堿時，溶液的pH值對該熒光物質(zhì)的熒光強度有較大影響。這是因為弱酸（堿）分子與其共軛堿（共軛酸）電子結(jié)構(gòu)有所不同。當溶劑pH值發(fā)生改變時，弱酸（堿）主要存在形式不同，因而具有不同的熒光。

大多數(shù)熒光物質(zhì)對溶劑的pH值很敏感，都有最適宜熒光發(fā)射的pH值范圍，實驗時應嚴格控制。

（4）散射光的影響

當一束平行光照射在液體樣品上，一部分光線透過溶液，一部分被分子吸收，另一部分由于光子和物質(zhì)分子相碰撞，光子的運動方向發(fā)生改變而向不同角度散射，這種光稱為散射光。

光子和物質(zhì)分子只發(fā)生彈性碰撞，不發(fā)生能量的交換，僅光子運動方向發(fā)生改變，其波長與入射光波長相同，這種散射光叫作瑞利光。

光子和物質(zhì)分子發(fā)生非彈性碰撞，光子運動方向改變的同時，光子與物質(zhì)分子發(fā)生能量交換，光子能量增加或減少，而發(fā)射出比入射光波長稍長或稍短的光，這種光稱為拉曼光。其中長波長光稱為Stokes線，而短波長光為反Stokes線，Stokes線比反Stokes線強度大。

瑞利光和拉曼光強度與激發(fā)波長有關，一般激發(fā)波長越短散射光越強，但拉曼光較瑞利光強度弱。瑞利光波長與激發(fā)波長相同，可通過選擇適當?shù)臒晒獠ㄩL或加入濾光片消除對熒光測定干擾。拉曼光波長與物質(zhì)熒光波長相近，對熒光測定的干擾大。可利用拉曼波長隨激發(fā)波長改變而改變，而熒光波長與激發(fā)波長無關的性質(zhì)，通過選擇適當?shù)募ぐl(fā)波長將二者區(qū)分開。

以硫酸奎寧為例，從圖5-4（a）可見，無論激發(fā)波長在320nm還是350nm，硫酸奎寧的最大熒光波長總是在448nm。從圖5-4（b）可見，用相同的激發(fā)波長照射空白溶劑，在激發(fā)光波長為320nm時，溶劑的瑞利光波長是320nm，拉曼光波長是360nm，360nm的拉曼光對熒光無影響。在激發(fā)光波長為350nm時，溶劑的瑞利光波長是350nm，拉曼光波長是400nm，400nm的拉曼光對熒光有干擾，因而影響測定結(jié)果。

表5-2為常用四種溶劑在不同波長激發(fā)光照射下拉曼光的波長。從表5-2中可見，四氯化碳的拉曼光與激發(fā)光的波長極為相近，所以其拉曼光幾乎不干擾熒光測定。而水、乙醇及環(huán)己烷的拉曼光波長較長，使用時必須注意。

（5）熒光猝滅劑的影響

熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其他分子相互作用，引起熒光強度降低或消失的現(xiàn)象稱為熒光猝滅。引起熒光猝滅的物質(zhì)稱為猝滅劑。根據(jù)熒光猝滅的機制分為動態(tài)猝滅（碰撞猝滅）、靜態(tài)猝滅、轉(zhuǎn)入三重態(tài)猝滅、自吸收猝滅。

碰撞猝滅又稱動態(tài)猝滅，是由于激發(fā)態(tài)熒光分子與猝滅劑分子碰撞而失去能量，無輻射躍遷回到基態(tài)，是引起熒光猝滅的主要原因。碰撞猝滅受擴散控制，服從Stern-Volmmer猝滅方程。當溶液黏度或猝滅劑濃度增加時，猝滅效應降低。靜態(tài)猝滅是熒光物質(zhì)與猝滅劑形成不能產(chǎn)生熒光的配合物。靜態(tài)猝滅可減小激發(fā)分子的濃度，改變熒光強度，但不改變熒光壽命。轉(zhuǎn)入三重態(tài)猝滅是由于引入高電荷重原子，使熒光分子由激發(fā)單重態(tài)轉(zhuǎn)入激發(fā)三重態(tài)后不能發(fā)射熒光。這種隨著重原子加入而出現(xiàn)的熒光強度減弱而磷光強度增強的現(xiàn)象稱為重原子效應。自吸收猝滅是熒光分子濃度增大后，一些分子的熒光發(fā)射光譜被另一些分子吸收，造成熒光強度降低。自吸收現(xiàn)象是因為熒光發(fā)射光譜的短波長端與其吸收光譜長波長端重疊造成。濃度越大，自吸收現(xiàn)象越嚴重，故也稱濃度猝滅。

O2是最常見的熒光猝滅劑，熒光分析時要除去溶劑中的氧。常見的熒光猝滅劑還包括：鹵素離子、重金屬離子、硝基化合物、重氮化合物、羰基和羧基化合物。

（6）氫鍵的影響

熒光物質(zhì)與溶劑或其他溶質(zhì)之間形成氫鍵，能顯著影響熒光物質(zhì)的熒光發(fā)射光譜和熒光強度。

（7）表面活性劑的影響

當表面活性劑濃度達到臨界膠束濃度時，表面活性劑會聚集形成膠束，然后熒光物質(zhì)被分散和固定在膠束中，降低了熒光物質(zhì)之間的碰撞概率，減少了分子的無輻射躍遷，提高了熒光效率，熒光強度增加。另外，熒光物質(zhì)被分散和固定在膠束中，增強了熒光物質(zhì)的穩(wěn)定性，降低熒光猝滅劑對熒光物質(zhì)的猝滅作用，同時也可降低熒光物質(zhì)的自猝滅，可提高熒光分析法的靈敏度和穩(wěn)定性。