3.2　光度法的誤差

3.2.1　偏離Beer定律的因素

根據上述Beer定律，當波長和入射光強度一定時，吸光度A與吸光物質的濃度c應成正比，即A-c曲線應為一條通過原點的直線。但在實際工作中，特別是當溶液濃度較高時，A-c曲線常會出現偏離直線的情況（圖3-6），即發生偏離Beer定律的現象。若所測試的溶液濃度在標準曲線的彎曲部分，必將產生較大的誤差。偏離Beer定律的因素主要有化學因素與光學因素。

（1）化學因素

Beer定律成立的前提通常應是稀溶液，隨著溶液濃度的改變，溶液中的吸光物質可因濃度的改變而發生離解、締合、溶劑化以及配合物生成等變化，使吸光物質的存在形式發生變化，影響物質對光的吸收能力，因而偏離Beer定律。

如重鉻酸鉀的水溶液中存在以下平衡：，若將溶液嚴格地稀釋2倍，則溶液中Cr2的濃度不是恰好減少為原來的一半，而是受稀釋平衡向右移動的影響，Cr2濃度的減少多于原來的一半，結果導致偏離Beer定律而產生誤差。不過若在強酸性溶液中測定Cr2或在強堿性溶液中測定Cr，則可避免上述偏離現象。由化學因素引起的偏離，有時可通過控制實驗條件加以避免。

（2）光學因素

①非單色光　由Beer定律的物理意義可知，Beer定律只適用于單色光。但事實上真正的單色光是難以得到的，實際應用中采用的光包含了所需波長的光和附近波長的光，即為具有一定波長范圍的光。這一寬度稱為譜帶寬度，常用半峰寬表示，即最大透光度一半處曲線的寬度（圖3-7）。實際應用于測量的都是具有一定譜帶寬度的復合光，因吸光物質對不同波長的光的吸收能力不同，遂導致了對Beer定律的偏離。

例如，按圖3-8所示的吸收光譜，用譜帶a所對應的波長進行測定，A隨波長的變化不大，引起的偏離就比較小。用譜帶b對應的波長進行測定，A隨波長的變化較明顯，就會產生較大的偏離。所以為了減小因非單色光所帶來的誤差，通常選擇吸光物質的最大吸收波長作為測定波長，同時應盡量避免采用尖銳的吸收峰進行定量分析。這樣既可以保證對Beer定律的偏離較小，又能保證測定有較高的靈敏度。

②雜散光　 從單色器得到的單色光中，還有一些不在譜帶范圍內的與所需波長相隔甚遠的光，稱為雜散光。它是因儀器光學系統的缺陷或光學元件受灰塵、霉蝕的影響而引起的，特別是在透光率很弱的情況下，會產生明顯的干擾作用。設入射光的強度為I0、透過光的強度為It、雜散光強度為Is，則觀測到的吸光度為：

A=lg　　 （3-8）

若樣品不吸收雜散光，則（I0+Is）/（It+Is）<I0/It，使A變小，產生負偏離。這種情況是分析中經常遇到的。隨著儀器制造工藝的提高，絕大部分波長內雜散光的影響可忽略不計，但在接近紫外末端處，雜散光的比例相對增大，干擾增強，甚至還會出現假峰。

③散射光和反射光　入射光通過吸收池內外界面之間時，界面產生反射作用，同時吸光質點對入射光又有散射作用。散射光和反射光均由入射光譜帶寬度內的光產生，對透射光強度有直接影響，均導致透射光強度減弱。真溶液散射作用較弱，可用空白溶液進行補償。渾濁溶液散射作用較強，一般不易制備相同的空白溶液，常使測得的吸光度產生偏離。

④非平行光　 Beer定律適用的另一個條件是平行光，但在實際檢測中，通過吸收池的光，通常都不是真正的平行光。傾斜光通過吸收池的實際光程將比垂直照射的平行光的光程長，使吸光度增加。這也是同一物質用不同儀器測定吸收系數時，產生差異的主要原因之一。

3.2.2　測量誤差

任何分光光度計都有一定的測量誤差，這是由于光源不穩定、讀數不準確等因素造成的。一般來說，透射比讀數誤差ΔT是一個常數，但在不同的讀數范圍內所引起的濃度的相對誤差卻是不同的，濃度測定結果的相對誤差與透光率測量誤差間的關系可由定律導出：

c==-

微分后并除以上式，可得濃度的相對誤差Δc/c為：

=　　 （3-9）

式（3-9）表明，濃度測量的相對誤差，取決于透光率T和透光率測量誤差ΔT的大小。上式表明，濃度測量的相對誤差，不但與分光光度計的讀數誤差ΔT有關，而且與透光率T也有關。ΔT由分光光度計透光率讀數精度所確定，以儀器的讀數誤差ΔT代入式（3-9），計算不同透光率或吸光度時的濃度相對誤差列于表3-2。

若以濃度相對誤差對T作圖可得到如圖3-9所示的函數曲線。從圖3-9中可見，溶液的透光率很大或很小時所產生的相對誤差都很大。只有中間一段即T值在65%～20%或A值在0.2～0.7之間時，濃度相對誤差較小，是測量的適宜范圍。將式（3-9）求極值可得到濃度相對誤差最小時的透光率或吸光度，即A=0.434，T=36.8%。但在實際工作中沒有必要去尋求這一最小誤差點，只要求測量的吸光度A在0.2～0.7適宜范圍內即可。

3.2.3　測量條件的選擇

（1）入射光波長的選擇

入射光波長選擇的依據是吸收曲線，一般以最大吸收波長λmax為測量的入射光波長。若被測物質存在干擾，且干擾物在λmax處也有吸收，則根據“吸收最大，干擾最小”的原則，在干擾最小的條件下選擇吸光度最大的波長。例如：KMnO4的測定一般選擇λmax=525nm，此時靈敏度最高。但若在K2Cr2O7存在下測量KMnO4時，則不選擇λmax =525nm，而是選擇另一最大吸收波長λ=545nm，因為此波長處K2Cr2O7不干擾KMnO4溶液吸光度的測定。

（2）吸光度范圍的選擇

當溶液的吸光度不在0.2～0.7范圍內時，可以通過改變稱樣量、稀釋溶液以及選擇不同厚度的比色皿來控制吸光度。

（3）參比溶液的選擇

選擇參比溶液的總原則是使試樣的吸光度能真正反映待測物的濃度。通常利用空白試驗來消除因溶劑或器皿對入射光反射和吸收帶來的誤差。參比溶液的選擇方法如下：

①純溶劑空白　在測定入射光波長下，溶液中只有被測組分對光有吸收，而顯色劑或其他組分對光沒有吸收，或雖有少許吸收，但所引起的測定誤差在允許范圍內，在此種情況下可用溶劑作為空白溶液。

②試劑空白　試劑空白是指在相同條件下只是不加試樣溶液，而依次加入各種試劑和溶劑所得到的空白溶液。試劑空白適用于在測定條件下，顯色劑或其他試劑、溶劑等對待測組分的測定有干擾的情況。

③試樣空白　試樣空白是指在與顯色反應同樣條件下取同樣量試樣溶液，只是不加顯色劑所制備的空白溶液。試樣空白適用于試樣基體有色并在測定條件下有吸收，而顯色劑溶液不干擾測定，也不與試樣基體顯色的情況。