第二節　蔬菜檢驗方法

一、新鮮蔬菜的取樣方法

1.取樣的一般要求

新鮮的蔬菜樣品不論進行現場常規鑒定還是送實驗室做品質安全檢測，一般要求隨機取樣。在某些特殊情況下，例如，為了查明混入的其他品種或者任意類型的混雜，允許進行選擇取樣，取樣之前要明確取樣的目的，即明確樣品的鑒定性質。抽取混合樣本，不能以單株（或單個果實）作為檢測樣本。抽樣過程中，應及時、準確記錄抽樣的相關信息。所抽樣本應經被抽單位或個人確認，生產地抽樣時應調查蔬菜生產、管理情況，市場抽樣應調查蔬菜來源或產地。

采集的貨物樣品，應能充分代表該批量貨物的全部特征。從樣品中剔除損壞的部分（箱、袋等），損壞和未損壞部分的樣品分別采集。

2.取樣準備

①抽樣前應制定抽樣方案。

②應事先準備好抽樣袋、保鮮袋、紙箱、標簽、封條（如需要）等抽樣用具，并保證這些用具潔凈、干燥、無異味，不會對樣本造成污染。抽樣過程不應受雨水、灰塵等環境的污染。

③抽樣人員應不少于2人。抽樣人員應持個人有效證件（身份證、工作證等）、抽查文件、記錄本、抽樣單和調查表等。

3.取樣時間

（1）生產地

根據不同品種在其種植區域的成熟期來確定，蔬菜取樣應安排在蔬菜成熟期或蔬菜即將上市前進行。

（2）批發市場

宜在批發或交易高峰時期取樣。

（3）農貿市場和超市

宜在抽取批發市場之前進行。

4.取樣方法

（1）生產地

當蔬菜種植面積小于10hm2（1hm2=104m2）時，每1～3hm2設為一個抽樣單元；當蔬菜種植面積大于10hm2，每3～5hm2設為一個抽樣單元。當在設施栽培的蔬菜大棚中抽樣時，每個大棚為一個抽樣單元。每個抽樣單元內根據實際情況按對角線法、梅花點法、棋盤式法、蛇形法等方法采取樣本，每個抽樣單元內抽樣點不應少于5個，每個抽樣點面積為1m2左右，隨機抽取該范圍內的蔬菜作為檢測用樣本。

生產地取樣一般每個樣本取樣量不低于3kg，單個個體大于0.5kg時，抽取樣本不少于10個個體，單個個體大于1kg時，抽取樣本不少于5個個體。取樣時，應除去泥沙、黏附物及明顯腐爛和萎蔫部分。

（2）批發市場

①批量貨物的取樣準備。批量貨物取樣，要求及時，每批貨物要單獨取樣。如果由于運輸過程發生損壞，其損壞部分（盒子、袋子等）必須與完成部分隔離，并進行單獨取樣。如果認為貨物不均勻，除貿易雙方另行磋商外，應當把正常部分單獨分出來，并從每一批中取樣鑒定。

②抽檢貨物的取樣準備。抽檢貨物要從批量貨物的不同位置和不同層次進行隨機取樣。

a.包裝產品。堆垛取樣時，在堆垛兩側的不同部位上、中、下或四角抽取相應數量的樣本。對有包裝的產品（木箱、紙箱、袋裝等），按照表4-1隨機取樣。

b.散裝產品。應視堆高不同從上、中、下分層取樣，每層從中心及四周五點取樣。取樣量與貨物的總量相適應，每批貨物至少取5個抽檢貨物。散裝產品抽檢貨物總量或貨物包裝的總數量按照表4-2抽取。在蔬菜或水果個體較大情況下（大于2kg/個），抽檢貨物至少由5個個體組成。

③農貿市場和超市。同一蔬菜樣本應從同一攤位抽取。

（3）填寫抽樣單

抽樣人員要與被檢單位代表共同確認樣本的真實性和代表性，抽樣完成后，要現場填寫抽樣單，抽樣單一式三份，由抽樣人員和被檢單位代表共同簽字或加蓋公章，一份交被檢單位，一份隨樣品，一份由抽樣人員帶回。

5.樣本的封存和運輸

（1）樣本的封存

樣本封存前要將“隨樣品”的抽樣單一并放在袋內，將樣本封存，粘好封條，要求標明封樣時間，封條應由雙方代表共同簽字。

（2）樣本的運輸

樣本應在24h內運送到實驗室，否則應將樣本冷凍后運輸。原則上不準郵寄和托運，應由抽樣人員隨身攜帶。在運輸過程中應避免樣本變質、受損或遭受污染。

6.樣本縮分

（1）場所

場所應通風、整潔、無揚塵、無易揮發化學物質。

（2）混合樣品或縮分樣品的制備

混合樣品的制備：混合樣品必須集合所有抽檢貨樣品，盡可能將樣品混合均勻。縮分樣品通過縮分混合樣品獲得。

對混合貨樣或縮分樣品，應當現場檢測。為了避免受檢樣品的性狀發生某種變化，取樣之后應當盡快完成檢驗工作。

二、大白菜總灰分及水溶性灰分堿度的測定

1.定義

①總灰分：按照本方法規定的條件，灼燒100g試樣所得殘灰的質量（g）。

②總灰分的堿度：按照本方法規定的條件，中和100g試樣所得的灰分所需的酸，以毫克當量計。

③水溶性灰分的堿度：按照本方法規定的條件，中和100g試樣所得的灰分水浸出物所需的酸，以毫克當量計。

總灰分和水溶性灰分的堿度也可以按堿指數表示。

④堿指數：按照本標準規定的條件，中和從試樣中所得的1g灰分所需的0.1mol/L酸溶液的體積（mL）。

2.原理

①總灰分：在（525±25）℃下用灼燒重量法測定。

②總灰分的堿度：在（525±25）℃下灰化制品，加過量的硫酸標準溶液，然后在指示劑存在的情況下，用氫氧化鈉標準溶液反滴定。

③水溶性灰分的堿度：在（525±25）℃下灰化制品，用熱水浸出灰分，然后在指示劑的存在下用硫酸標準溶液中和水浸出物。

3.試劑與儀器

全部試劑均為分析純，均用不含二氧化碳的蒸餾水配制。

①c（1/2H2SO4）=0.1mol/L硫酸標準溶液。

②0.1mol/L氫氧化鈉標準溶液。

③指示劑：加10g/L甲基藍溶液4mL于100mL的1g/L甲基橙溶液中。

④坩堝：30～50mL的石英坩堝或瓷坩堝（一次性使用）。

⑤馬福爐（muffle furnace）。

4.檢測過程

（1）總灰分的測定

①坩堝的恒重。用稀鹽酸（1+4）將坩堝煮1～2h，洗凈置于馬福爐內（525±25）℃下灼燒30min，待爐溫降至200℃以下時，將坩堝移入干燥器中，冷卻至室溫稱重，準確至0.0001g，重復灼燒至恒重。

②試樣的制備。均勻地混合實驗室樣品。如樣品經密閉冷凍保存，則必須令其解凍，溫度回升至室溫后均勻取樣。

③試驗部分。稱新鮮大白菜5.10g，稱準至0.001g，置于一預先恒重的坩堝內。

④炭化。以小火加熱使樣品充分炭化至無煙。

⑤灰化。將炭化完全的試樣放入馬弗爐中，于（525±25）℃下灰化直至無炭化物殘留為止。待爐溫降至200℃以下時，將坩堝移入干燥器中，冷卻至室溫稱重，稱準至0.0001g，重復灼燒至恒重。

（2）灰分堿度的測定

①總灰分堿度的測定。準確吸取約10～15mL的硫酸標準溶液處理灰化中所得的灰分，定量地移入200mL的錐形瓶中，用少量熱水漂洗坩堝，在電熱板上煮沸加液至透明，然后冷卻至室溫，加2滴混合指示劑，用氫氧化鈉標準溶液滴定至溶液由淺紫色變為橙黃色。

②水溶性灰分的堿度。加約20mL熱水于灰化所得的灰分中，全部移入一漏斗中的毯紙內，然后用少量熱水洗滌濾紙上的殘留物，將洗滌液并入濾液，待濾液冷卻后加2或3滴混合指示劑，用硫酸標準溶液滴定至溶液由橙黃色變為淺紫色。

5.結果表示

（1）計算方法和公式

①總灰分。以灼燒100g試樣所得的灰分質量表示：

　　（4-1）

式中　X——總灰分，%；

m1——試樣灰化后所得灰分的質量g；

m——試樣的質量，g。

②總灰分的堿度

a.總灰分的堿度。以100g試樣中的毫克當量數表示，按下式計算：

　　（4-2）

b.總灰分的堿指數。以每克灰分所需的0.1mol/L酸溶液的體積（mL）表示，按下式計算：

　　（4-3）

式中　A——總灰分的堿度，毫克當量；

n——總灰分的堿指數；

N1——硫酸標準溶液的濃度；

V1——在“總灰分堿度的測定”中所加的硫酸標準溶液的體積，mL；

N2——氫氧化鈉標準溶液的物質的量濃度；

V2——在“總灰分堿度的測定”中所加的氫氧化鈉標準溶液的體積，mL；

m——試樣的質量，g；

m1——試樣灰化后所得灰分的質量，g。

③水溶性灰分的堿度

a.水溶性灰分的堿度。以100g試樣中毫克當量數表示，按下式計算：

　　（4-4）

b.水溶性灰分的堿指數。以每克灰分的0.5mol/L酸溶液的毫升數表示，按下式計算：

　　（4-5）

式中　Aw——水溶性灰分的堿度；

nw——水溶性灰分的堿指數；

N1——硫酸標準溶液的物質的量濃度；

V'1——在“水溶性灰分的堿度”中所加入的硫酸標準溶液的體積，mL；

m'——試樣的質量，g；

m'1——試樣灰化后所得灰分的質量，g。

液體樣品的結果以100mL試樣中的含量表示。

若符合重復性的要求，取兩次測定的算術平均值作為結果。結果保留到小數點后二位。

（2）重復性

同一分析者同時或相繼兩次測定的結果的相對誤差均不超過5%。

本標準中的恒重要求均為兩次測定之差不超過0.0005g。

三、芹菜中粗纖維的測定（GB/T 5009.10—2003）

1.原理

芹菜試樣在硫酸作用下，試樣中的糖、淀粉、果膠質和半纖維素經水解除去后，再用堿處理，除去蛋白質及脂肪酸，剩余的殘渣為粗纖維。如其中含有不溶于酸堿的雜質，可灰化后除去。

2.試劑

①1.25%硫酸。

②1.25%氫氧化鉀溶液。

③石棉：加5%氫氧化鈉溶液浸泡石棉，在水浴上回流8h以上，再用熱水充分洗滌，然后用20%鹽酸在沸水浴上回流8h以上，再用熱水充分洗滌，干燥，在600～700℃中灼燒后，加水成為混懸物，儲存于玻塞瓶中。

3.分析步驟

①稱取20～30g搗碎的芹菜試樣（或5.0g干試樣），移入500mL錐形瓶中，加入200mL煮沸的1.25%硫酸，加熱使微沸，保持體積恒定，維持30min，每隔5min搖動錐形瓶一次，以充分混合瓶內的物質。

②取下錐形瓶，立即用亞麻布過濾后，用沸水洗滌至洗液不呈酸性。

③再用200mL煮沸的1.25%氫氧化鉀溶液，將亞麻布上的存留物洗入原錐形瓶內，加熱微沸30min后，取下錐形瓶，立即以亞麻布過濾，以沸水洗滌2～3次后，移入已干燥稱量的G2垂融坩堝或同型號的垂融漏斗中，抽濾，用熱水充分洗滌后，抽干。再依次用乙醇和乙醚洗滌一次。將坩堝和內容物在105℃烘箱中烘干后稱量，重復操作，直至恒量。

如試樣中含有較多的不溶性雜質，則可將試樣移入石棉坩堝，烘干稱量后，再移入550℃高溫爐中灰化，使含碳的物質全部灰化，置于干燥器內，冷卻至室溫稱量，所損失的量即為粗纖維量。

④結果按式（4-6）進行計算。

　　（4-6）

式中　X——試樣中粗纖維的含量；

G——殘余物的質量（或經高溫爐損失的質量），g；

m——試樣的質量，g；

計算結果表示到小數點后一位。

4.精密度

在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的10%。

四、蔬菜中維生素C含量的測定

1.原理

染料2，6-二氯靛酚的顏色反應表現兩種特性，一是取決于其氧化還原狀態，氧化態為深藍色，還原態變為無色，二是受其介質的酸度影響，在堿性溶液中呈深藍色，在酸性介質中呈淺紅色。

用藍色的堿性染料標準溶液，對含維生素C的酸性浸出液進行氧化還原滴定，染料被還原為無色，當到達滴定終點時，多余的染料在酸性介質中則表現為淺紅色，由染料用量計算樣品中還原型抗壞血酸的含量。

2.儀器設備

①高速組織搗碎機：8000～12000r/min。

②分析天平。

③滴定管：25mL、10mL。

④容量瓶：100mL、50mL。

⑤錐形瓶：100mL、50mL。

⑥吸管：10mL、5mL、2mL、1mL。

⑦燒杯：250mL、50mL。

⑧漏斗。

3.試劑（凡未加說明者均為分析純）

（1）浸提劑

①偏磷酸：2%溶液（質量濃度）。

②草酸：2%溶液（質量濃度）。

（2）抗壞血酸標準溶液（1mg/mL）

稱取100mg（準確至0.1mg）抗壞血酸，溶于浸提劑中并稀至100mL，現配現用。

（3）2.6一二氯靛酚（2，6-二氯靛酚吲哚酚鈉鹽）溶液

稱取碳酸氫鈉52mg溶解在200mL熱蒸餾水中，然后稱取2，6-二氯靛酚50mg溶解在上述碳酸氫鈉溶液中。冷卻定容至250mL，過濾至棕色瓶內，保存在冰箱中。每次使用前，用標準抗壞血酸標定其滴定度。即吸取1mL抗壞血酸標準溶液于50mL錐形瓶中，加入10mL浸提劑，搖勻，用2，6-二氯靛酚溶液滴定至溶液呈粉紅色15s不褪色為止。同時，另取10mL浸提劑做空白試驗。

滴定度按式（4-7）計算：

　　（4-7）

式中　T——每毫升2，6-二氯靛酚溶液相當于抗壞血酸的毫克數，mg/mL；

c——抗壞血酸的濃度，mg/mL；

V——吸取抗壞血酸的體積，mL；

V1——滴定抗壞血酸溶液所用2，6-二氯靛酚溶液的體積，mL；

V2——滴定空白所用2，6-二氯靛酚溶液的體積，mL。

（4）白陶土（或稱高嶺土）

白陶土對維生素C無吸附性。

4.測定步驟

（1）樣液制備

稱取具有代表性樣品的可食部分100g，放入組織搗碎機中，加100mL浸提劑，迅速搗成勻漿。稱10～40g漿狀樣品，用浸提劑將樣品移入100mL容量瓶，并稀釋至刻度，搖勻過濾。若濾液有色，可按每克樣品加0.4g白陶土脫色后再過濾。

（2）滴定

吸取10mL濾液放入50mL錐形瓶中，用已標定過的2，6-二氯靛酚溶液滴定，直至溶液呈粉紅色15s不褪色為止。同時做空白試驗。

5.結果計算

①計算公式。維生素C含量按式（4-8）計算：

　　（4-8）

式中　V——滴定樣液時消耗染料溶液的體積，mL；

V0——滴定空白時消耗染料溶液的體積，mL；

T——2，6-二氯靛酚染料滴定度，mg/mL；

A——稀釋倍數；

W——樣品重量，g。

②平行測定的結果。用算術平均值表示，取三位有效數字，含量低的保留小數點后兩位數字。

③平行測定結果的相對相差。在維生素C含量大于20mg/100g時，不得超過2%，小于20mg/100g時，不得超過5%。

五、蔬菜中亞硝酸鹽的測定

（一）紫外分光光度法

1.原理

用pH=9.6～9.7的氨緩沖液提取樣品中硝酸根離子，同時加活性炭去除色素類，加沉淀劑去除蛋白質及其他干擾物質，利用硝酸根離子和亞硝酸根離子在紫外區219nm處具有等吸收波長的特性，測定提取液的吸光度，其測得結果為硝酸鹽和亞硝酸鹽吸光度的總和，鑒于新鮮蔬菜、水果中亞硝酸鹽含量甚微，可忽略不計。測定結果為硝酸鹽的吸光度，可從工作曲線上查得相應的質量濃度，計算樣品中硝酸鹽的含量。

2.試劑和材料

除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純。水為GB/T 6682—2008規定的一級水。

（1）試劑

①鹽酸（HCl，ρ=1.19g/mL）。

②氨水（NH3·H2O，25%）。

③亞鐵氰化鉀［K4Fe（CN）6·3H2O］。

④硫酸鋅（ZnSO4·7H2O）。

⑤正辛醇（C8H18O）。

⑥活性炭（粉狀）。

（2）試劑配制

①氨緩沖溶液（pH=9.6～9.7）：量取20mL鹽酸，加入到500mL水中，混合后加入50mL氨水，用水定容至1000mL，調pH值至9.6～9.7。

②亞鐵氰化鉀溶液（150g/L）：稱取150g亞鐵氰化鉀溶于水，定容至1000mL。

③硫酸鋅溶液（300g/L）：稱取300g硫酸鋅溶于水，定容至1000mL。

（3）標準品

硝酸鉀（KNO3，CAS號為7757-79-1）：基準試劑，或采用具有標準物質證書的硝酸鹽標準溶液。

（4）標準溶液配制

①硝酸鹽標準儲備液（500mg/L，以硝酸根計）：稱取0.2039g于110～120℃干燥至恒重的硝酸鉀，用水溶解并轉移至250mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻。此溶液硝酸根質量濃度為500mg/L，于冰箱內保存。

②硝酸鹽標準曲線工作液：分別吸取0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL和1.2mL硝酸鹽標準儲備液于50mL容量瓶中，加水定容至刻度，混勻。此標準系列溶液硝酸根質量濃度分別為0mg/L、2.0mg/L、4.0mg/L、6.0mg/L、8.0mg/L、10.0mg/L和12.0mg/L。

3.儀器和設備

①紫外分光光度計。

②分析天平：感量0.01g和0.0001g。

③組織搗碎機。

④可調式往返振蕩機。

⑤pH計：精度為0.01。

4.分析步驟

（1）試樣制備

選取一定數量有代表性的樣品，先用自來水沖洗，再用水清洗干凈，晾干表面水分，用四分法取樣，切碎，充分混勻，于組織搗碎機中勻漿（部分少汁樣品可按一定質量比例加入等量水），在勻漿中加1滴正辛醇消除泡沫。

（2）提取

稱取10g（精確至0.01g）勻漿試樣（如制備過程中加水，應按加水量折算）于250mL錐形瓶中，加水100mL，加入5mL氨緩沖溶液（pH=9.6～9.7）、2g粉末狀活性炭，振蕩（往復速度為200次/min）30min。定量轉移至250mL容量瓶中，加入2mL 150g/L亞鐵氰化鉀溶液和2mL 300g/L硫酸鋅溶液，充分混勻，加水定容至刻度，搖勻，放置5min，上清液用定量濾紙過濾，濾液備用。同時做空白實驗。

（3）測定

根據試樣中硝酸鹽含量的高低，吸取上述濾液2～10mL于50mL容量瓶中，加水定容至刻度，混勻。用1cm石英比色皿，于219nm處測定吸光度。

（4）標準曲線的制作

將標準曲線工作液用1cm石英比色皿，于219nm處測定吸光度。以標準溶液質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制工作曲線。

5.結果計算

硝酸鹽（以硝酸根計）的含量按式（4-9）計算：

　　（4-9）

式中　X——試樣中硝酸鹽的含量，mg/kg；

ρ——由工作曲線獲得的試樣溶液中硝酸鹽的質量濃度，mg/L；

V1——提取液定容體積，mL；

V3——待測液定容體積，mL；

m——試樣的質量，g；

V2——吸取的濾液體積，mL。

結果保留2位有效數字。

6.精密度

在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的10%。

（二）離子色譜法

1.原理

采用相應的方法提取和凈化，以氫氧化鉀溶液為淋洗液，陰離子交換柱分離，電導檢測器或紫外檢測器檢測，保留時間定性，外標法定量。

2.試劑和材料

除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682規定的一級水。

（1）試劑

①乙酸（CH3COOH）。

②氫氧化鉀（KOH）。

（2）試劑配制

①乙酸溶液（3%）：量取乙酸3mL于100mL容量瓶中，以水稀釋至刻度，混勻。

②氫氧化鉀溶液（1mol/L）：稱取6g氫氧化鉀，加入新煮沸過的冷水溶解，并稀釋至100mL，混勻。

（3）標準品

①亞硝酸鈉（NaNO2，CAS號為7632-00-0）：基準試劑，或采用具有標準物質證書的亞硝酸鹽標準溶液。

②硝酸鈉（NaNO3，CAS號為7631-99-4）：基準試劑，或采用具有標準物質證書的硝酸鹽標準溶液。

（4）標準溶液的制備

①亞硝酸鹽標準儲備液（100mg/L，以N計，下同）：準確稱取0.1500g于110～120℃干燥至恒重的亞硝酸鈉，用水溶解并轉移至1000mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻。

②硝酸鹽標準儲備液（1000mg/L，以N計，下同）：準確稱取1.3710g于110～120℃干燥至恒重的硝酸鈉，用水溶解并轉移至1000mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻。

③亞硝酸鹽和硝酸鹽混合標準中間液：準確移取亞硝酸根離子（N）和硝酸根離子（N）的標準儲備液各1.0mL于100mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，每升此溶液含亞硝酸根離子1.0mg和硝酸根離子10.0mg。

④亞硝酸鹽和硝酸鹽混合標準使用液：移取亞硝酸鹽和硝酸鹽混合標準中間液，加水逐級稀釋，制成系列混合標準使用液，亞硝酸根離子濃度分別為0.02mg/L、0.04mg/L、0.06mg/L、0.08mg/L、0.10mg/L、0.15mg/L、0.20mg/L；硝酸根離子濃度分別為0.2mg/L、0.4mg/L、0.6mg/L、0.8mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L。

3.儀器和設備

（1）離子色譜儀：配電導檢測器及抑制器或紫外檢測器，高容量陰離子交換柱，50μL定量環。

（2）食物粉碎機。

（3）超聲波清洗器。

（4）分析天平：感量為0.1mg和1mg。

（5）離心機：轉速≥10000r/min，配50mL離心管。

（6）0.22μm水性濾膜針頭濾器。

（7）凈化柱：包括C18柱、Ag柱和Na柱或等效柱。

（8）注射器：1.0mL和2.5mL。

注：所有玻璃器皿使用前均需依次用2mol/L氫氧化鉀和水分別浸泡4h，然后，用水沖洗3～5次，晾干備用。

4.分析步驟

（1）試樣預處理

將新鮮蔬菜試樣用自來水洗凈后，用水沖洗，晾干后，取可食部切碎混勻。將切碎的樣品用四分法取適量，用食物粉碎機制成勻漿，備用。如需加水應記錄加水量。

（2）提取

稱取蔬菜試樣5g（精確至0.001g，可適當調整試樣的取樣量），置于150mL具塞錐形瓶中，加入80mL水，1mL1mol/L氫氧化鉀溶液，超聲提取30min，每隔5min振搖1次，保持固相完全分散。于75℃水浴中放置5min，取出放置至室溫，定量轉移至100mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻。溶液經濾紙過濾后，取部分溶液于10000r/min離心15min，上清液備用。

（3）儀器參考條件

①色譜柱：氫氧化物選擇性，可兼容梯度洗脫的二乙烯基苯-乙基苯乙烯共聚物基質，烷醇基季銨鹽功能團的高容量陰離子交換柱，4mm×250mm（帶保護柱4mm×50mm），或性能相當的離子色譜柱。

②淋洗液：氫氧化鉀溶液，濃度為6～70mmol/L；洗脫梯度為6mmol/L30min，70mmol/L 5min，6mmol/L 5min；流速為1.0mL/min。

③抑制器：電導檢測器，檢測池溫度為35℃；或紫外檢測器，檢測波長為226nm；進樣體積為50μL（可根據試樣中被測離子含量進行調整）。

（4）測定

①標準曲線的制作。將標準系列工作液分別注入離子色譜儀中，得到各濃度標準工作液色譜圖，測定相應的峰高或峰面積，以標準工作液的濃度為橫坐標，以峰高或峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

②試樣溶液的測定。將空白溶液和試樣溶液注入離子色譜儀中，得到空白溶液和試樣溶液的峰高或峰面積，根據標準曲線得到待測液中亞硝酸根離子或硝酸根離子的濃度。

5.結果計算

試樣中亞硝酸離子或硝酸根離子的含量按式（4-10）計算：

　　（4-10）

式中　X——試樣中亞硝酸根離子或硝酸根離子的含量，mg/kg；

ρ——測定用試樣溶液中的亞硝酸根離子或硝酸根離子濃度，mg/L；

ρ0——試劑空白液中亞硝酸根離子或硝酸根離子的濃度，mg/L；

V——試樣溶液體積，mL；

f——試樣溶液稀釋倍數；

1000——換算系數；

m——試樣取樣量，g。

試樣中測得的亞硝酸根離子含量乘以換算系數1.5，即得亞硝酸鹽（按亞硝酸鈉計）含量；試樣中測得的硝酸根離子含量乘以換算系數1.37，即得硝酸鹽（按硝酸鈉計）含量。

結果保留2位有效數字。

6.精密度

在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的10%。

7.其他

亞硝酸鹽和硝酸鹽檢出限分別為0.2mg/kg和0.4mg/kg。

（三）分光光度法

1.原理

亞硝酸鹽采用鹽酸萘乙二胺法測定，硝酸鹽采用鎘柱還原法測定。

試樣在弱酸條件下，亞硝酸鹽與對氨基苯磺酸重氮化后，再與鹽酸萘乙二胺偶合形成紫紅色染料，外標法測得亞硝酸鹽含量。采用鎘柱將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，測得亞硝酸鹽總量，由測得的亞硝酸鹽總量減去試樣中亞硝酸鹽含量，即得試樣中硝酸鹽含量。

2.試劑和材料

除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682—2008規定的一級水。

（1）試劑

①亞鐵氰化鉀［K4Fe（CN）6·3H2O］。

②乙酸鋅［Zn（CH3COO）2·2H2O］。

③冰醋酸（CH3COOH）。

④硼酸鈉（Na2B4O7·10H2O）。

⑤鹽酸（HCl，ρ=1.19g/mL）。

⑥氨水（NH3·H2O，25%）。

⑦對氨基苯磺酸（C6H7NO3S）。

⑧鹽酸萘乙二胺（C12H14N2·2HCl）。

⑨鋅皮或鋅棒。

⑩硫酸鎘（CdSO4·8H2O）。

硫酸銅（CuSO4·5H2O）。

（2）試劑配制

①亞鐵氰化鉀溶液（106g/L）：稱取106.0g亞鐵氰化鉀，用水溶解，并稀釋至1000mL。

②乙酸鋅溶液（220g/L）：稱取220.0g乙酸鋅，先加30mL冰醋酸溶解，用水稀釋至1000mL。

③飽和硼砂溶液（50g/L）：稱取5.0g硼酸鈉，溶于100mL熱水中，冷卻后備用。

④氨緩沖溶液（pH=9.6～9.7）：量取30mL鹽酸，加100mL水，混勻后加65mL氨水，再加水稀釋至1000mL，混勻，調節pH值至9.6～9.7。

⑤氨緩沖液的稀釋液：量取50mLpH=9.6～9.7氨緩沖溶液，加水稀釋至500mL，混勻。

⑥鹽酸（0.1mol/L）：量取8.3mL鹽酸，用水稀釋至1000mL。

⑦鹽酸（2mol/L）：量取167mL鹽酸，用水稀釋至1000mL。

⑧鹽酸（20%）：量取20mL鹽酸，用水稀釋至100mL。

⑨對氨基苯磺酸溶液（4g/L）：稱取0.4g對氨基苯磺酸，溶于100mL 20%鹽酸中，混勻，置棕色瓶中，避光保存。

⑩鹽酸萘乙二胺溶液（2g/L）：稱取0.2g鹽酸萘乙二胺，溶于100mL水中，混勻，置棕色瓶中，避光保存。

硫酸銅溶液（20g/L）：稱取20g硫酸銅，加水溶解，并稀釋至1000mL。

硫酸鎘溶液（40g/L）：稱取40g硫酸鎘，加水溶解，并稀釋至1000mL。

乙酸溶液（3%）：量取冰醋酸3mL于100mL容量瓶中，以水稀釋至刻度，混勻。

（3）標準品

①亞硝酸鈉（NaNO2，CAS號為7632-00-0）：基準試劑，或采用具有標準物質證書的亞硝酸鹽標準溶液。

②硝酸鈉（NaNO3，CAS號為7631-99-4）：基準試劑，或采用具有標準物質證書的硝酸鹽標準溶液。

（4）標準溶液配制

①亞硝酸鈉標準溶液（200μg/mL，以亞硝酸鈉計）：準確稱取0.1000g于110～120℃干燥恒重的亞硝酸鈉，加水溶解，移入500mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻。

②硝酸鈉標準溶液（200μg/mL，以硝酸鈉計）：準確稱取0.1232g于110～120℃干燥恒重的硝酸鈉，加水溶解，移入500mL容量瓶中，并稀釋至刻度。

③亞硝酸鈉標準使用液（5.0μg/mL）：臨用前，吸取2.50mL亞硝酸鈉標準溶液，置于100mL容量瓶中，加水稀釋至刻度。

④硝酸鈉標準使用液（5.0μg/mL，以硝酸鈉計）：臨用前，吸取2.50mL硝酸鈉標準溶液，置于100mL容量瓶中，加水稀釋至刻度。

3.儀器和設備

①天平：感量為0.1mg和1mg。

②組織搗碎機。

③超聲波清洗器。

④恒溫干燥箱。

⑤分光光度計。

⑥鎘柱或鍍銅鎘柱。

a.海綿狀鎘的制備：鎘粒直徑0.3～0.8mm。將適量的鋅棒放入燒杯中，用40g/L硫酸鎘溶液浸沒鋅棒。在24h之內，不斷將鋅棒上的海綿狀鎘輕輕刮下。取出殘余鋅棒，使鎘沉底，傾去上層溶液。用水沖洗海綿狀鎘2～3 次后，將鎘轉移至攪拌器中，加400mL鹽酸（0.1mol/L），攪拌數秒，以得到所需粒徑的鎘顆粒。將制得的海綿狀鎘倒回燒杯中，靜置3～4h，期間攪拌數次，以除去氣泡。傾去海綿狀鎘中的溶液，并可按下述方法進行鎘粒鍍銅。

b.鎘粒鍍銅：將制得的鎘粒置于錐形瓶中（所用鎘粒的量以達到要求的鎘柱高度為準），加足量的鹽酸（2mol/L）浸沒鎘粒，振蕩5min，靜置分層，傾去上層溶液，用水多次沖洗鎘粒。在鎘粒中加入20g/L硫酸銅溶液（每克鎘粒約需2.5mL），振蕩1min，靜置分層，傾去上層溶液后，立即用水沖洗鍍銅鎘粒（注意鎘粒要始終用水浸沒），直至沖洗的水中不再有銅沉淀。

c.鎘柱的裝填：如圖4-1所示，用水裝滿鎘柱玻璃柱，并裝入約2cm 高的玻璃棉，將玻璃棉壓向柱底時，應將其中所包含的空氣全部排出，在輕輕敲擊下，加入海綿狀鎘至8～10cm［圖4-1（a）］或15～20cm［圖4-1（b）］，上面用1cm 高的玻璃棉覆蓋。若使用裝置B，則上置一儲液漏斗，末端要穿過橡皮塞與鎘柱玻璃管緊密連接。

如無上述鎘柱玻璃管時，可以25mL酸式滴定管代用，但過柱時要注意始終保持液面在鎘層之上。

當鎘柱填裝好后，先用25mL鹽酸（0.1mol/L）洗滌，再以水洗2次，每次25mL，鎘柱不用時用水封蓋，隨時都要保持水平面在鎘層之上，不得使鎘層夾有氣泡。

d.鎘柱每次使用完畢后，應先以25mL鹽酸（0.1mol/L）洗滌，再以水洗2次，每次25mL，最后用水覆蓋鎘柱。

e.鎘柱還原效率的測定：吸取20mL硝酸鈉標準使用液，加入5mL氨緩沖液的稀釋液，混勻后注入儲液漏斗，使流經鎘柱還原，用一個100mL 的容量瓶收集洗提液。洗提液的流量不應超過6mL/min，在儲液杯將要排空時，用約15mL水沖洗杯壁。沖洗水流盡后，再用15mL水重復沖洗，第2次沖洗水也流盡后，將儲液杯灌滿水，并使其以最大流量流過柱子。當容量瓶中的洗提液接近100mL時，從柱子下取出容量瓶，用水定容至刻度，混勻。取10.0mL還原后的溶液（相當10μg亞硝酸鈉）于50mL 比色管中，以下按4.（3）自“吸取0.00mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mL……”起操作，根據標準曲線計算測得結果，與加入量一致，還原效率應大于95%為符合要求。

f.還原效率計算按式（4-11）計算：

　　 （4-11）

式中　X——還原效率，%；

m1——測得亞硝酸鈉的含量，μg；

10 ——測定用溶液相當亞硝酸鈉的含量，μg。

如果還原率小于95%時，將鎘柱中的鎘粒倒入錐形瓶中，加入足量的鹽酸（2moL/L）中，振蕩數分鐘，再用水反復沖洗。

4.分析步驟

（1）試樣的預處理

同紫外分光光度法中分析步驟的試樣制備。

（2）提取

稱取5g（精確至0.001g）勻漿試樣（如制備過程中加水，應按加水量折算），置于250mL具塞錐形瓶中，加12.5mL50g/L飽和硼砂溶液，加入70℃左右的水約150mL，混勻，于沸水浴中加熱15min，取出置冷水浴中冷卻，并放置至室溫。定量轉移上述提取液至200mL容量瓶中，加入5mL 106g/L亞鐵氰化鉀溶液，搖勻，再加入5mL 220g/L乙酸鋅溶液，以沉淀蛋白質。加水至刻度，搖勻，放置30min，除去上層脂肪，上清液用濾紙過濾，棄去初濾液30mL，濾液備用。

（3）亞硝酸鹽的測定

吸取40.0mL上述濾液于50mL帶塞比色管中，另吸取0.00mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL、2.50mL亞硝酸鈉標準使用液（相當于0.0μg、1.0μg、2.0μg、3.0μg、4.0μg、5.0μg、7.5μg、10.0μg、12.5μg亞硝酸鈉），分別置于50mL帶塞比色管中。于標準管與試樣管中分別加入2mL 4g/L對氨基苯磺酸溶液，混勻，靜置3～5min后各加入1mL 2g/L鹽酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混勻，靜置15min，用1cm 比色杯，以零管調節零點，于波長538nm 處測吸光度，繪制標準曲線比較。同時做試劑空白。

（4）硝酸鹽的測定

①鎘柱還原：先以25mL氨緩沖液的稀釋液沖洗鎘柱，流速控制在3～5mL/min（以滴定管代替的可控制在2～3mL/min）；吸取20mL濾液于50mL燒杯中，加5mL pH=9.6～9.7氨緩沖溶液，混合后注入儲液漏斗，使流經鎘柱還原，當儲液杯中的樣液流盡后，加15mL水沖洗燒杯，再倒入儲液杯中。沖洗水流完后， 再用15mL水重復1次。當第2次沖洗水快流盡時，將儲液杯裝滿水，以最大流速過柱。當容量瓶中的洗提液接近100mL時，取出容量瓶，用水定容刻度，混勻。

②亞硝酸鈉總量的測定：吸取10～20mL還原后的樣液于50mL比色管中，然后按4（3）自“吸取0.00mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mL……”起操作。

5.結果計算

（1）亞硝酸鹽含量的計算

亞硝酸鹽（以亞硝酸鈉計）的含量按式（4-12）計算：

　　 （4-12）

式中　X1——試樣中亞硝酸鈉的含量，mg/kg；

m2 ——測定用樣液中亞硝酸鈉的質量，μg；

1000——轉換系數；

m5——試樣質量，g；

V1——測定用樣液體積，mL；

V0——試樣處理液總體積，mL。

結果保留2位有效數字。

（2）硝酸鹽含量的計算

硝酸鹽（以硝酸鈉計）的含量按式（4-13）計算：

　　（4-13）

式中　X2——試樣中硝酸鈉的含量，mg/kg；

m1——經鎘粉還原后測得總亞硝酸鈉的質量，μg；

1000——轉換系數；

m2——試樣的質量，g；

V3——測總亞硝酸鈉的測定用樣液體積，mL；

V2——試樣處理液總體積，mL；

V1——經鎘柱還原后樣液的測定用體積，mL；

V4 ——經鎘柱還原后樣液總體積，mL；

X1 ——由式（4-12）計算出的試樣中亞硝酸鈉的含量，mg/kg；

1.232——亞硝酸鈉換算成硝酸鈉的系數。

結果保留2位有效數字。

6.精密度

在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的10%。

六、蔬菜有機磷農藥殘留量的測定——速測卡法

1.原理

膽堿酯酶可催化靛酚乙酸酯（紅色）水解為乙酸與靛酚（藍色），有機磷或氨基甲酸酯類農藥對膽堿酯酶有抑制作用，使催化、水解、變色的過程發生改變，由此可判斷樣品中是否有有機磷或氨基甲酸酯類農藥的存在。

2.試劑

①固化有膽堿酯酶和靛酚乙酸酯試劑的紙片（速測卡）。

②pH=7.5緩沖溶液：分別取15.0g磷酸氫二鈉 ［Na2HPO4·12H2O］與1.59g無水磷酸二氫鉀［KH2PO4 ］，用500mL蒸餾水溶解。

3.儀器

①常量天平。

②有條件時配備37℃±2℃恒溫裝置。

4.分析步驟

（1）整體測定法

①選取有代表性的蔬菜樣品，擦去表面泥土，剪成1cm左右見方碎片，取5g放入帶蓋瓶中，加入10mL緩沖溶液，振搖50次，靜置2min以上。

②取一片速測卡，用白色藥片沾取提取液，放置10min以上進行預反應，有條件時在37℃恒溫裝置中放置10min。預反應后的藥片表面必須保持濕潤。

③將速測卡對折，用手捏3min或用恒溫裝置恒溫3min，使紅色藥片與白色藥片疊合反應。

④每批測定應設一個緩沖液的空白對照卡。

（2）表面測定法（粗篩法）

①擦去蔬菜表面泥土，滴2～3滴緩沖溶液在蔬菜表面，用另一片蔬菜在滴液處輕輕摩擦。

②取一片速測卡，將蔬菜上的液滴滴在白色藥片上。

③放置10min以上進行預反應，有條件時在37℃恒溫裝置中放置10min。預反應后的藥片表面必須保持濕潤。

④將速測卡對折，用手捏3min或用恒溫裝置恒溫3min，使紅色藥片與白色藥片疊合反應。

⑤每批測定應設一個緩沖液的空白對照卡。

5.結果判定

結果以酶被有機磷或氨基甲酸酯類農藥抑制（為陽性）、未抑制（為陰性）表示。

與空白對照卡比較，白色藥片不變色或略有淺藍色均為陽性結果。白色藥片變為天藍色或與空白對照卡相同，為陰性結果。

對陽性結果的樣品，可用其他分析方法進一步確定具體農藥品種和含量。

6.附則

①靈敏度指標：速測卡對部分常見農藥的檢出限及我國限量標準見表4-3。

②符合率：在檢出的50份以上陽性樣品中，經氣相色譜法驗證，陽性結果的符合率應該在80%以上。

7.說明

蔥、蒜、蘿卜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇及番茄汁液中，含有對酶有影響的次生物質，容易產生假陽性。處理這類樣品時，可采取整棵蔬菜萃取或采用表面測定法。對一些含葉綠素較高的蔬菜，也可采取整株蔬菜萃取的方法，減少干擾因素。

七、蔬菜有機磷農藥殘留的檢測——酶抑制法（GB/T 5009.199—2003）

1.原理

在一定條件下，有機磷和氨基甲酸酯類農藥對膽堿酯酶的正常功能有抑制作用，其抑制率與農藥的濃度呈正相關。正常情況下，酶催化神經傳導代謝產物（乙酰膽堿）水解，其水解產物與顯色劑反應，產生黃色物質，用分光光度計在412nm處測定吸光度隨時間的變化值，計算出抑制率，通過抑制率可以判斷出樣品中是否有高劑量有機磷或氨基甲酸酯類農藥的存在。

2.試劑

①pH=8.0緩沖溶液：分別取11.9g無水磷酸氫二鉀與3.2g磷酸二氫鉀，用1000mL蒸餾水溶解。

②顯色劑：分別取160mg二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）和15.6mg碳酸氫鈉，用20mL緩沖溶液溶解，在4℃冰箱中保存。

③底物：取25.0mg硫代乙酰膽堿，加3.0mL蒸餾水溶解，搖勻后置于4℃冰箱中保存備用。保存期不超過兩周。

④乙酰膽堿酯酶：根據酶的活性情況，用緩沖溶液溶解，3min的吸光度變化DA0值應控制在0.3以上。搖勻后置于4℃冰箱中保存備用，保存期不超過四天。

⑤可選用由以上試劑制備的試劑盒。乙酰膽堿酯酶的DA0值應控制在0.3以上。

3.儀器

①分光光度計或相應測定儀。

②常量天平。

③恒溫水浴或恒溫箱

4.分析步驟

（1）樣品處理

選取有代表性的蔬菜樣品，沖洗掉表面泥土，剪成1cm左右見方碎片，取樣品1g，放入燒杯或提取瓶中，加入5mL緩沖溶液，振蕩1～2min，倒出提取液，靜置3～5min，待用。

（2）對照溶液測試

先于試管中加入2.5mL緩沖溶液，再加入0.1mL酶液、0.1mL顯色劑，搖勻后于37℃放置15min以上（每批樣品的控制時間應一致）。加入0.1mL底物搖勻，此時檢液開始顯色反應，應立即放入儀器比色池中，記錄反應3min的吸光度變化值DA0。

（3）樣品溶液測試

先于試管中加入2.5mL樣品提取液，其他操作與對照溶液測試相同，記錄反應3min的吸光度變化值DAt。

5.結果計算

（1）結果計算

檢測結果按公式計算：抑制率=［（DA0-DAt）/DA0］×100%

式中　DA0——對照溶液反應3min吸光度的變化值；

DAt——樣品溶液反應3min吸光度的變化值；

（2）結果判定

結果以酶被抑制的程度（抑制率）表示。當蔬菜樣品提取液對酶的抑制率≥50%時，表示蔬菜中有高劑量有機磷或氨基甲酸酯類農藥存在，樣品為陽性結果。陽性結果的樣品需要重復檢驗2次以上。

對陽性結果的樣品，可用其他方法進一步確定具體農藥品種和含量。

6.附則

①靈敏度指標：酶抑制法對部分農藥的檢出限見表4-4。

②符合率：在檢出的抑制率≥50%的30份以上樣品中，經氣相色譜法驗證，陽性結果的符合率應該在80%以上。

7.說明

①蔥、蒜、蘿卜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇及番茄汁液中，含有對酶有影響的次生物質，容易產生假陽性。處理這類樣品時，可采取整棵蔬菜萃取或采用表面測定法。對一些含葉綠素較高的蔬菜，也可采取整株蔬菜萃取的方法，減少色素的干擾。

②當溫度條件低于37℃，酶反應的速率隨之放慢，加入酶液和顯色劑后放置反應的時間應相應延長，延長時間的確定，應以膽堿酯酶空白對照測試，3min吸光度變化差值在0.3以上，即可往下操作。注意樣品放置時間應與空白對照溶液放置時間一致才有可比性。膽堿酯酶空白對照測試3min吸光度變化差值在0.3以下的原因：一是酶的活性不夠，二是溫度太低。

八、蔬菜有機磷類、擬除蟲菊酯類和有機氯類農藥殘留量的測定——氣相色譜檢測法

（一）蔬菜中有機磷類農藥多殘留的測定

1.原理

試樣中有機磷類農藥經乙腈提取，提取溶液經過濾、濃縮后，用丙酮定容，用雙自動進樣器同時注入氣相色譜儀的兩個進樣口，農藥組分經不同極性的兩根毛細管柱分離，火焰光度檢測器（FPD 磷濾光片）檢測，用雙柱的保留時間定性，外標法定量。

2.試劑與材料

除非另有說明，在分析中僅使用的是分析純的試劑和GB/T 6682中規定的至少二級的水。

①乙腈。

②丙酮，重蒸。

③氯化鈉，140℃烘烤4h。

④濾膜，0.2μm，溶劑膜。

⑤鋁箔。

⑥農藥標準品，見表4-5。

⑦農藥標準溶液配制。

a.單一農藥標準溶液。準確稱取一定量（精確至0.1mg）某農藥標準品，用丙酮做溶劑，逐一配制成1000mg/L 的單一農藥標準儲備液，儲存在-18℃以下冰箱中。使用時根據各農藥在對應檢測器上的響應值，準確吸取適量的標準儲備液，用丙酮稀釋配制成所需的標準工作液。

b.農藥混合標準溶液。將54種農藥分為4組，按照表4-5中組別，根據各農藥在儀器上的響應值，逐一準確吸取一定體積的同組別的單個農藥儲備液，分別注入同一容量瓶中，用丙酮稀釋至刻度，采用同樣方法配制成4 組農藥混合標準儲備溶液。使用前用丙酮稀釋成所需質量濃度的標準工作液。

3.儀器設備

①氣相色譜儀，帶有雙火焰光度檢測器（FPD 磷濾光片），雙自動進樣器，雙分流/不分流進樣口。

②分析實驗室常用儀器設備。

③食品加工器。

④旋渦混合器。

⑤勻漿機。

⑥氮吹儀。

4.分析步驟

（1）試樣制備

按GB/T 8855—2008 抽取蔬菜、水果樣品，取可食部分，經縮分后，將其切碎，充分混勻放入食品加工器中粉碎，制成待測樣，放入分裝容器中于-20～-16℃條件下保存，備用。

（2）提取

準確稱取25.0g試樣放入勻漿機中，加入50.0mL乙腈，在勻漿機中高速勻漿2min后用濾紙過濾，濾液收集到裝有5～7g氯化鈉的100mL具塞量筒中，收集濾液40～50mL，蓋上塞子，劇烈振蕩1min，在室溫下靜置30min，使乙腈相和水相分層。

（3）凈化

從具塞量筒中吸取10.00mL乙腈溶液，放入150mL燒杯中，將燒杯放在80℃水浴鍋上加熱，杯內緩緩通入氮氣或空氣流，蒸發近干，加入2.0mL丙酮，蓋上鋁箔，備用。將上述備用液完全轉移至15mL刻度離心管中，再用約3mL丙酮分三次沖洗燒杯，并轉移至離心管，最后定容至5.0mL，在旋渦混合器上混勻，分別移入兩個2mL自動進樣器樣品瓶中，供色譜測定。如定容后的樣品溶液過于混濁，應用0.2μm濾膜過濾后再進行測定。

（4）測定

①色譜參考條件

a.色譜柱。預柱，1.0m，0.53mm內徑，脫活石英毛細管柱。兩根色譜柱，分別為：

ⅰ.A柱：50%聚苯基甲基硅氧烷（DB-17或HP-50+）1柱，30m×0.53mm×1.0μm，或相當者；

ⅱ.B柱：100%聚甲基硅氧烷（DB-1或HP-1）1柱，30m×0.53mm×1.50μm，或相當者。

b.溫度。進樣口溫度220℃。檢測器溫度，250℃。柱溫，150℃保持2min，以8℃/min升溫至250℃保持12min。

c.氣體及流量。載氣：氮氣，純度≥99.999%，流速為10mL/min。燃氣：氫氣，純度≥99.999%，流速為75mL/min。助燃氣：空氣，流速為100mL/min。

d.進樣方式。不分流進樣。樣品溶液一式兩份，由雙自動進樣器同時進樣。

②色譜分析。由自動進樣器分別吸取1.0μL標準混合溶液和凈化后的樣品溶液注入色譜儀中，以雙柱保留時間定性，以A柱獲得的樣品溶液峰面積與標準溶液峰面積比較定量。

5.結果表述

（1）定性分析

雙柱測得樣品溶液中未知組分的保留時間（RT）分別與標準溶液在同一色譜柱上的保留時間（RT）相比較，如果樣品溶液中某組分的兩組保留時間與標準溶液中某一農藥的兩組保留時間相差都在±0.05min內的可認定為該農藥。

（2）結果計算

試樣中被測農藥殘留量以質量分數w計，單位以毫克每千克（mg/kg）表示，按式（4-14）計算。

　　（4-14）

式中　ρ——標準溶液中農藥的質量濃度，mg/L；

A——樣品溶液中被測農藥的峰面積；

AS——農藥標準溶液中被測農藥的峰面積；

V1——提取溶劑總體積，mL；

V2——吸取出用于檢測的提取溶液的體積，mL；

V3——樣品溶液定容體積，mL；

m——試樣的質量，g。

計算結果保留兩位有效數字，當結果大于1mg/kg時保留三位有效數字。

6.精密度

本標準精密度數據是按照GB/T 6379.2—2004規定確定的，獲得重復性和再現性的值以95%的可信度來計算。

7.色譜圖

有機磷農藥標準溶液的色譜圖見圖4-2。

（二）蔬菜中有機氯類、擬除蟲菊酯類農藥多殘留的測定

1.原理

試樣中有機氯類、擬除蟲菊酯類農藥用乙腈提取，提取液經過濾、濃縮后，采用固相萃取柱分離、凈化，淋洗液經濃縮后，用雙塔自動進樣器同時將樣品溶液注入氣相色譜儀的兩個進樣口，農藥組分經不同極性的兩根毛細管柱分離，電子捕獲檢測器（ECD）檢測，雙柱保留時間定性，外標法定量。

2.試劑與材料

除非另有說明，在分析中僅使用的是分析純的試劑和GB/T 6682中規定的至少二級的水。

①乙腈。

②丙酮，重蒸。

③己烷，重蒸。

④氯化鈉，140℃烘烤4h。

⑤固相萃取柱，弗羅里硅柱（FlorisilPR），容積6mL，填充物1000mg。

⑥鋁箔。

⑦農藥標準品，見表4-6。

⑧農藥標準溶液配制。

a.單個農藥標準溶液。準確稱取一定量（精確至0.1mg）農藥標準品，用正己烷稀釋，逐一配制成1000mg/L單一農藥標準儲備液，儲存在-18℃以下冰箱中。使用時根據各農藥在對應檢測器上的響應值，準確吸取適量的標準儲備液，用正己烷稀釋配制成所需的標準工作液。

b.農藥混合標準溶液。將41種農藥分為3組，按照表4-6中組別，根據各農藥在儀器上的響應值，逐一吸取一定體積的同組別的單個農藥儲備液，分別注入同一容量瓶中，用正己烷稀釋至刻度，采用同樣方法配制成3組農藥混合標準儲備溶液。使用前用正己烷稀釋成所需質量濃度的標準工作液。

3.儀器設備

①氣相色譜儀，配有雙電子捕獲檢測器（ECD），雙塔自動進樣器，雙分流/不分流進樣口。

②分析實驗室常用儀器設備。

③食品加工器。

④旋渦混合器。

⑤勻漿機。

⑥氮吹儀。

4.測定步驟

（1）試樣制備

同蔬菜中有機磷類農藥多殘留測定中的試樣制備部分。

（2）提取

同蔬菜中有機磷類農藥多殘留測定中的提取部分。

（3）凈化

從100mL具塞量筒中吸取10.00mL乙腈溶液，放入150mL燒杯中，將燒杯放在80℃水浴鍋上加熱，杯內緩緩通入氮氣或空氣流，蒸發近干，加入2.0mL正己烷，蓋上鋁箔，待凈化。將弗羅里硅柱依次用5.0mL丙酮+正己烷（10+90）、5.0mL正己烷預淋洗，條件化，當溶劑液面到達柱吸附層表面時，立即倒入上述待凈化溶液，用15mL刻度離心管接收洗脫液，用5mL丙酮+正己烷（10+90）沖洗燒杯后淋洗弗羅里硅柱，并重復一次。將盛有淋洗液的離心管置于氮吹儀上，在水浴溫度50℃條件下，氮吹蒸發至小于5mL，用正己烷定容至5.0mL，在旋渦混合器上混勻，分別移入兩個2mL自動進樣器樣品瓶中，待測。

（4）測定

①色譜參考條件

a.色譜柱。預柱，1.0m，0.25mm內徑，脫活石英毛細管柱。分析柱采用兩根色譜柱，分別為：

ⅰ.A柱：100%聚甲基硅氧烷（DB-1或HP-1）1柱，30m×0.25mm×0.25μm，或相當者；

ⅱ.B柱：50%聚苯基甲基硅氧烷（DB-17或HP-50+）1柱，30m×0.25mm×0.25μm，或相當者。

b.溫度。進樣口溫度，200℃。檢測器溫度，320℃。

柱溫，150℃保持2min，以6℃/min升溫至270℃保持8min（測定溴氰菊酯保持23min）。

c.氣體及流量。載氣：氮氣，純度≥99.999%，流速為1mL/min。輔助氣：氮氣，純度≥99.999%，流速為60mL/min。

d.進樣方式。分流進樣，分流比為10∶1。樣品溶液一式兩份，由雙塔自動進樣器同時進樣。

②色譜分析。由自動進樣器分別吸取1.0μL標準混合溶液和凈化后的樣品溶液注入色譜儀中，以雙柱保留時間定性，以A柱獲得的樣品溶液峰面積與標準溶液峰面積比較定量。

5.結果計算

（1）定性分析

雙柱測得的樣品溶液中未知組分的保留時間（RT）分別與標準溶液在同一色譜柱上的保留時間（RT）相比較，如果樣品溶液中某組分的兩組保留時間與標準溶液中某一農藥的兩組保留時間相差都在±0.05min內的可認定為該農藥。

（2）定量結果計算

試樣中被測農藥殘留量以質量分數w計，單位以毫克每千克（mg/kg）表示，按式（4-15）計算。

　　（4-15）

式中　ρ——標準溶液中農藥的質量濃度，mg/L；

A——樣品溶液中被測農藥的峰面積；

AS——農藥標準溶液中被測農藥的峰面積；

V1——提取溶劑總體積，mL；

V2——吸取出用于檢測的提取溶液的體積，mL；

V3——樣品溶液定容體積，mL；

m——試樣的質量，g。

計算結果保留兩位有效數字，當結果大于1mg/kg時保留三位有效數字。

6.精密度

本標準精密度數據是按照GB/T 6379.2的規定確定的，獲得重復性和再現性的值以95%的可信度來計算。

7.色譜圖

有機氯標準溶液的色譜圖見圖4-3。

1—α-666；2—西瑪津；3—莠去津；4—δ-666；5—七氯；6—艾氏劑；7—o，p'-DDE；8—p，p'-DDE；9—o，p'-DDD；10—p，p'-DDT；11—異菌脲；12—聯苯菊酯；13—順式氯菊酯；14—氟氯氰菊酯；15—氟胺氰菊酯；16—β-666；17—林丹；18—五氯硝基苯；19—敵稗；20—乙烯菌核利；21—硫丹；22—p，p'-DDD；23—三氯殺螨醇；24—高效氯氟氰菊酯；25—氯菊酯；26—氟氰戊菊酯；27—氯硝胺；28—六氯苯；29—百菌清；30—三唑酮；31—腐霉利；32—丁草胺；33—狄氏劑；34—異狄氏劑；35—乙酯殺螨醇；36—o，p'-DDT；37—胺菊酯；38—甲氰菊酯；39—氯氰菊酯；40—氰戊菊酯；41—溴氰菊酯

九、蔬菜中33種農藥殘留量的測定——液相色譜-串聯質譜法

1.適用范圍

本方法適用于水果和蔬菜中滅多威、多菌靈、嘧霉胺、甲萘威、克百威、啶蟲脒、滅線磷、地蟲硫磷、吡蟲啉、敵百蟲、辛硫磷、磷胺、殺撲磷、苯線磷、除蟲脲、氯唑磷、稻豐散、治螟磷、蠅毒磷、噠螨靈、伏殺硫磷、咪鮮胺、烯酰嗎啉、嘧菌酯、苯醚甲環唑、甲氨基阿維菌素苯甲維鹽、乙草胺、烯啶蟲胺、丙草胺、茚蟲威、氟蟲脲、茚蟲威和亞胺硫磷等農藥殘留的檢測。

2.原理

試樣用乙腈勻漿提取，鹽析離心，Spe-Pak vac柱凈化，用乙腈+甲苯（3+1）洗脫農藥及相關化學品，液相色譜-串聯質譜儀測定，外標法定量。

3.試劑和材料

水為GB/T 6682—2008規定的一級水。

①乙腈：色譜純。

②正己烷：色譜純。

③異辛烷：色譜純。

④甲苯：優級純。

⑤丙酮：色譜純。

⑥二氯甲烷：色譜純。

⑦甲醇：色譜純。

⑧微孔過濾膜（尼龍）：13mm×0.2μm。

⑨Sep-Pak vac氨基固相萃取柱：1g，6mL，或相當者。

⑩乙腈+甲苯（3+1，體積比）。

乙腈+水（3+2，體積比）。

0.05%甲酸溶液（體積分數）。

5mmol/L乙酸銨溶液：稱取0.375g乙酸銨加水稀釋至1000mL。

無水硫酸鈉：分析純，用前在650℃灼燒4h，儲于干燥器中，冷卻后備用。

氯化鈉：優級純。

農藥及相關化學品標準物質：純度≥95%。

農藥及相關化學品標準溶液。

a.標準儲備溶液。分別稱取5～10mg（精確至0.1mg）農藥及相關化學品標準物于10mL容量瓶中，根據標準物的溶解度選甲醇、甲苯、丙酮、乙腈或異辛烷等溶劑溶解并定容至刻度。標準儲備溶液避光在0～4℃保存，可使用一年。

b.混合標準溶液。根據每種農藥及相關化學品在儀器上的響應靈敏度，確定其在混合標準溶液中的濃度。

移取一定量的單個農藥及相關化學品標準儲備溶液于100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。混合標準溶液避光在0～4℃保存，可使用一個月。

c.基質混合標準工作溶液。農藥及相關化學品基質混合標準工作溶液是用空白樣品基質溶液配成不同濃度的基質混合標準工作溶液，用于做標準工作曲線。

基質混合標準工作溶液應現用現配。

4.儀器

①液相色譜-串聯質譜儀：配有電噴霧離子源（ESD）。

②分析天平：感量為0.1mg和0.01g。

③高速組織搗碎機：轉速不低于20000r/min。

④離心管：80mL。

⑤離心機：最大轉速為4200r/min。

⑥旋轉蒸發儀。

⑦雞心瓶：200mL。

⑧移液管：1mL。

⑨樣品瓶：2mL，帶聚四氟乙烯旋蓋。

⑩氮氣吹干儀。

5.試樣制備與保存

（1）試樣的制備

按GB/T 8855—2008抽取的水果、蔬菜樣品取可食部分切碎，混勻，密封，作為試樣，標明標記。

（2）試樣的保存

將試樣置于0～4℃冷藏保存。

6.測定步驟

（1）提取

稱取20g試樣（精確至0.01g）于80mL離心管中，加入40mL乙腈，用高速組織搗碎機在15000r/min，勻漿提取1min，加入5g氯化鈉，再勻將提取1min，在3800r/min離心5min，取上清液20mL（相當于10g試樣量），在40℃水浴中旋轉濃縮至約1mL，待凈化。

（2）凈化

在Sep-Pak vac柱中加入約2cm高無水硫酸鈉，并放入下接雞心瓶的固定架上。加樣前先用4mL乙腈+甲苯（3+1）預洗柱，當液面到達硫酸鈉的頂部時，迅速將樣品濃縮液轉移至凈化柱上，并更新雞心瓶接收。再每次用2mL乙腈+甲苯（3+1）洗滌樣液瓶三次，并將洗滌液移入柱中。在柱上加上50mL儲液器，用25mL乙腈+甲苯（3+1）洗脫農藥及相關化學品，合并于雞心瓶中，并在40℃水浴中旋轉濃縮至約0.5mL。將濃縮液置于氮氣吹干儀上吹干，迅速加入1mL的乙腈+水（3+2），混勻，經0.2μm濾膜過濾后進行液相色譜-串聯質譜測定。

（3）液相色譜-串聯質譜測定

①液相色譜-串聯質譜測定條件

a色譜柱：超純硅膠基質反相C18色譜柱（atlantis T3），3μm，150mm×2.1mm（內徑）或相當者。

b.流動相及梯度洗脫條件見表4-17。

c.柱溫：40℃。

d.進樣量：20μL。

e.離子源：ESI。

f.掃描方式：正離子掃描。

g.檢測方式：多反應監測。

h.電噴霧電壓：5000V。

i.霧化氣壓力：0.483MPa。

j.氣簾氣壓力：0.138MPa。

k.輔助加熱氣壓力：0.379MPa。

l.離子源溫度：725℃。

②定性測定。在相同實驗條件下進行樣品測定時，如果檢出的色譜峰的保留時間與標準樣品相一致，并且在扣除背景后的樣品質譜圖中，所選擇的離子均出現，而且所選擇的離子豐度比與標準樣品的離子豐度比相一致（相對豐度＞50%，允許±20%偏差；相對豐度＞20%～50%，允許±25%偏差；相對豐度＞10%～20%，允許±30%偏差；相對豐度≤10%，允許±50%偏差），則可判斷樣品中存在這種農藥或相關化學品。

③定量測定。本標準中液相色譜-串聯質譜采用外標-校準曲線法定量測定。為減少基質對定量測定的影響，定量用標準溶液應采用基質混合標準工作溶液繪制標準曲線，并且保證所測樣品中農藥及相關化學品的響應值均在儀器的線性范圍內。

（4）平行試驗

按以上步驟對同一試樣進行平行試驗。

（5）空白試驗

除不稱取試樣外，均按上述步驟進行。

7.結果計算

液相色譜-串聯質譜測定采用標準曲線定量，標準曲線法定量結果按式（4-16）計算：

　　（4-16）

式中　X——試樣中被測組分含量，mg/kg；

ci——從標準工作曲線得到的試樣溶液中被測組分的濃度，μg/mL；

V——試樣溶液定容體積，mL；

m——樣品溶液所代表試樣的質量，g。

計算結果應扣除空白值。

8.精密度

本標準精密度數據是按照GB/T 6379.1—2004和GB/T 6379.2—2004的規定確定的，獲得重復性和再現性的值是以95%的可信度來計算。