任務1.2　天然藥物化學成分的分離

天然藥物化學成分可以根據物質的溶解度差別、在兩相溶劑中的配比不同、吸附性能差別、分子大小差別、離解程度不同等因素進行分離。

1.2.1　系統溶劑法

1.2.1.1　原理

系統溶劑法是根據不同化學成分的極性差異，選用幾種不同極性的溶劑組成溶劑系統，由低極性到高極性逐步對濃縮后的總提取物進行提取分離。常用的溶劑見表1.2。

1.2.1.2　適用范圍

系統溶劑法是早年研究天然藥物化學有效成分的一種最主要的方法，主要用于分離提純含有不同極性的各種化學成分的提取，目前仍用于不明化學成分的分離。但此法在微量成分、結構性質相似成分的分離純化上有很大局限性。

1.2.2　兩相溶劑萃取法

兩相溶劑萃取法又稱“萃取法”。在提取液中加入一種與其不混溶的溶劑，充分振搖以增加相互接觸的機會，使原提取液中的某種成分逐漸轉溶到加入的溶劑中，而其他成分仍留在原提取液中，從而實現分離。

1.2.2.1　原理

在一定的溫度和壓力下，某物質在兩種互不相溶的溶劑中溶解，達到動態平衡時，該物質在兩種溶劑相中的濃度之比為一常數，稱為分配系數（K）。可用下式表示：

K=cU/cL

式中，K為分配系數；cU為溶質在上相溶劑中的濃度；cL為溶質在下相溶劑中的濃度。

混合物中各種成分在同一兩相溶劑系統中分別有各自不同的分配系數。萃取時混合物中各種成分在兩相溶劑中分配系數差異越大，則分離效果越好。分離的難易可用分離因子（β）來表示。分離因子為A、B兩種溶質在同一溶劑系統中分配系數的比值。可用下式表示：

β=KA/KB（KA>KB）

β≥100，一次萃取就可實現基本分離；100>β≥10，需萃取10～12次；β≤2，需萃取100次以上；β≈1，無法實現分離。

因此在實際工作中，應選擇β值大的溶劑系統，以簡化分離過程，提高分離效果。也可根據β大小選擇合適的分離方法。

1.2.2.2　萃取方法

（1）簡單萃取法

實驗室用分液漏斗或下口瓶，一般選擇容積較被萃取液大1～2倍的分液漏斗。工業上可用大型密閉的萃取缸。適用于分配系數差異較大的成分的分離。萃取中常產生乳化現象，可通過靜置、加熱、鹽析、改變表面張力等方式解決。

（2）pH梯度萃取法

pH梯度萃取法的操作同簡單萃取法。將待分離成分溶于與水不相溶的有機溶劑，依次選用pH值由低到高的堿水溶液作萃取劑進行萃取，可使不同成分按照酸性由強至弱的順序分離出來。若選用pH值由高至低的酸性緩沖溶液作萃取劑順次萃取，可使堿性由強到弱的生物堿分別萃取出來。

（3）逆流連續萃取法

逆流連續萃取法利用兩溶液密度不同自然分層，分散相液滴穿過連續相溶劑時發生傳質。此法可避免用分液漏斗多次萃取操作造成的麻煩和乳化現象的發生。其原理如圖1.6所示，高槽內放密度小的有機溶劑，管子內裝入水提取液，柱子內部填充瓷圈或玻璃填充物，萃取就可以連續進行。

①逆流分溶法（counter current distribution，CCD）是一種高效、多次、連續的兩相溶劑萃取分離方法，亦稱逆流分配法、逆流分布法或反流分布法。如圖1.7所示，將提取物加入到第一管中，在流動相和固定相之間達到分配平衡，然后由流動相帶入第二管中完成分配平衡，反復重復操作，混合物中各成分根據在兩相的分配系數的不同，以一定速率遷移到各管中，直至最后，在各管中保留在固定相中分配比由大到小的各物質。

逆流分溶法具有很強的分離混合物各組分的能力，特別適合于分離中等極性、分離因子較小及不穩定的物質，甚至對一些用色譜法不能分離的高分子化合物如多肽、蛋白質等都已進行成功分離。但此法不適于分離微量成分、試樣極性過大或過小，以及分配系數受溫度或濃度影響過大及易于產生乳化現象的溶劑系統。

②液滴逆流分配法（droplet counter current chromatography，DCCC）又稱液滴逆流色譜法，是在逆流分溶法基礎上改進的新方法。其原理與逆流分溶法相似，利用混合物中各成分在兩液相間的分配系數的差異，使流動相形成液滴，通過作為固定相的液柱實現逆流分配，從而達到分離目的。此法使用溶劑較少，可定量回收溶劑，不需振蕩，不會產生乳化現象，分離效果好于CCD法，廣泛應用于皂苷、生物堿、蛋白質、糖類等中藥化學成分的分離與精制，特別是分離皂苷，效果良好。

③高速逆流色譜法（high speed counter current chromatography，HSCCC）是一種不用任何同態載體的液-液色譜技術，其原理是基于組分在旋轉螺旋管內的相對移動時在互不混溶的兩相溶劑間分布不同而獲得分離，其分離效率和速度可以與HPLC法相媲美。HSCCC法分離效率高，產品純度高；不存在載體對樣品的吸附和污染；制備量大和溶劑消耗少；操作簡單，能從極復雜的混合物中分離出特定的組分。該法已廣泛用于皂苷、酚類、生物堿、蛋白質、糖類等中藥化學成分的分離精制，效果良好。

1.2.3　結晶法

天然藥物化學成分在常溫下多半呈固態，都具有結晶的通性，可以根據溶解度的不同，用結晶法來達到分離精制的目的。研究天然藥物化學成分時，一旦獲得結晶，就能有效地進一步精制成為單體純品。純化合物的結晶有一定的熔點和結晶學的特征，有利于鑒定。

（1）基本原理

結晶法是利用不同溫度可引起物質溶解度的改變的性質來分離混合物中的不同成分。非結晶狀態的物質通過溫度的改變出現結晶的操作稱為結晶。不純的結晶物進一步結晶處理得到較純的結晶的操作稱為重結晶。結晶后的液體稱為母液。

（2）溶劑的選擇

溶劑的沸點要適中；與結晶物不發生反應；對所需要的成分冷時溶解度較小，而熱時溶解度較大；對雜質冷熱均溶，或冷熱均不溶；能給出很好的晶型。溶劑一般常用甲醇、丙酮、三氯甲烷、乙醇、乙酸乙酯等。除選用單一溶劑外，也常采用混合溶劑。一般是將化合物溶于易溶的溶劑中，在室溫下滴加適量的難溶的溶劑，直至溶液微呈渾濁，并將此溶液微微加溫，使溶液完全澄清后，放置結晶。例如β-細辛醚重結晶時，可先溶于乙醇，再滴加適量水，即可析出很好的結晶。又如從虎杖中提取水溶性的虎杖苷時，可在已飽和的水溶液上加上一層乙醚，既可溶出脂溶性雜質，又可降低水的極性，促使虎杖苷的結晶化。自秦皮中提取七葉苷（秦皮甲素）也可運用這樣的辦法。

（3）結晶法操作

通常將需結晶物質置于錐形瓶中，加入少量的溶劑，于水浴上加熱至微沸，逐步添加溶劑，直至所需結晶物質剛好完全溶解，趁熱過濾，靜置，冷卻析晶。然后采用減壓抽濾，把結晶從母液中分離出來。晶體需用少量溶劑洗滌，以除去表面的母液。上述得到的結晶為粗晶，仍含有雜質，需反復進行重結晶后才可得到較純晶體。結晶后的母液，再經處理又可分別得到第二批、第三批結晶，這種方法則稱為分步結晶法或分級結晶法。

（4）結晶純度的判定

化合物的結晶都有一定的結晶形狀、色澤、熔點和熔距，可以作為鑒定的初步依據。結晶的形狀和熔點往往因所用溶劑不同而有差異。原托品堿在三氯甲烷中形成棱柱狀結晶，熔點207℃；在丙酮中則形成半球狀結晶，熔點203℃；在三氯甲烷和丙酮混合溶劑中則形成以上兩種晶形的結晶。所以在化合物的晶形、熔點之后需注明所用溶劑。一般單體純化合物結晶的熔距較窄，要求在0.5℃左右，如果熔距較長則表示化合物不純。

（5）注意事項

結晶過程中，溶液濃度高，降溫快，析出結晶的速度快。但是其結晶的顆粒較小，雜質多。有時自溶液中析出的速度太快，超過化合物晶核的形成和分子定向排列的速度，往往只能得到無定形粉末。有時溶液太濃，黏度大反而不易結晶化。如果溶液濃度適當，溫度慢慢降低，有可能析出結晶較大而純度較高的結晶。有的化合物其結晶的形成需要較長的時間，例如鈴蘭毒苷等，有時需放置數天或更長的時間。如果放置一段時間后沒有結晶析出，可以加種晶誘導晶核形成。

1.2.4　沉淀法

1.2.4.1　基本原理

沉淀法是在藥物提取液中加入某些試劑，生成沉淀或降低其溶解性而從溶液中析出，從而獲得有效成分或去除雜質的方法。采用沉淀法分離化合物，若生成沉淀的是有效成分，則要求沉淀反應必須可逆，以便化合物再生。

1.2.4.2　沉淀法操作

（1）酸堿沉淀法

利用某些成分在酸或堿中溶解，繼而又在堿或酸中生成沉淀的性質達到分離的方法。這種方法是可逆的，可使有效成分與雜質分離。常用的有酸提取堿沉法、堿提取酸沉法、等電點沉淀法等。

（2）改變極性，降低溶解度沉淀法

改變溶劑的極性，讓某些成分沉淀。例如在水提濃縮液中加入乙醇達60%，可使多糖、蛋白質、樹膠等逐步沉淀出來。于醇提取濃縮液中加入10倍量以上水，可沉淀親脂性成分，如油脂、葉綠素、色素等。在藥材濃縮的乙醇提取液中加入數倍量乙醚（醇提醚沉法）或丙酮（醇提丙酮沉淀法），可使皂苷沉淀析出。

（3）專屬試劑沉淀法

例如在生物堿鹽的溶液中，加入某些生物堿沉淀試劑生成不溶性復鹽而析出。水溶性生物堿難以用萃取法提取分出，常加入雷氏銨鹽使生成生物堿雷氏鹽沉淀析出。此外，還可以用明膠、蛋白溶液沉淀鞣質，膽甾醇也常用于沉淀洋地黃皂苷等。

（4）鉛鹽沉淀法

乙酸鉛及堿式乙酸鉛在水及醇溶液中，能與多種天然藥物化學成分生成難溶的鉛鹽或絡鹽沉淀，故可利用這種性質使有效成分與雜質分離。常用中性乙酸鉛和堿式乙酸鉛。中性乙酸鉛可沉淀酸性物質或某些酚性物質，堿式乙酸鉛沉淀范圍更廣。

鉛鹽沉淀可懸浮于新溶劑中，通以硫化氫氣體，轉為不溶性硫化鉛而沉淀。溶液中可能存有多余的硫化氫，須通入空氣或二氧化碳帶出多余的硫化氫氣體。也可用硫酸、磷酸、硫酸鈉、磷酸鈉等除鉛，但生成的鉛鹽在水中仍有一定的溶解度，除鉛不徹底。用陽離子交換樹脂脫鉛快而徹底，但要注意藥液中某些有效成分也可能被交換上去，同時脫鉛樹脂再生也較困難。

（5）絮凝沉淀法

在提取濃縮液中加入一種絮凝沉淀劑，以吸附架橋或電中和方式與蛋白質果膠等發生分子間作用，使之沉降，除去溶液中的粗粒子，以達到精制和提高成品質量目的。絮凝劑的種類很多，有鞣酸、明膠、蛋清、101果汁澄清劑、ZTC澄清劑、殼聚糖等。

（6）鹽析法

鹽析法是在藥物的水提液中加入無機鹽至一定濃度，或達到飽和狀態，可使某些成分在水中的溶解度降低沉淀析出。常用作鹽析的無機鹽有氯化鈉、硫酸鈉、硫酸鎂、硫酸銨等。例如在三七的水提取液中加硫酸鎂至飽和狀態，三七皂苷即可沉淀析出；自黃藤中提取掌葉防己堿、自三顆針中提取小檗堿在生產上都是用氯化鈉或硫酸銨進行鹽析。有些成分如原白頭翁素、麻黃堿、苦參堿等水溶性較大，在提取時，可先在水提取液中加入一定量的氯化鈉，再用有機溶劑萃取。

1.2.5　膜分離法

膜分離法是利用天然或人工合成的高分子膜，以外加壓力或化學位差為推動力，對混合液的化學成分進行分離、分級、提純。提取液中小分子物質或能在水、乙醇提取液中解離成離子的物質可通過透析膜，而大分子物質（如多糖、蛋白質、鞣質、樹脂等）不能通過透析膜，從而達到分離。目前膜分離法主要有反滲透、超濾、微濾、電滲析四種。

1.2.6　升華法

固態物質不經過液態過程，直接蒸發變成蒸氣的過程叫作“升華”。某些天然藥物化學成分具有升華性，如某些小分子生物堿、香豆素等均可用升華法進行純化。但在升華過程中，往往伴隨熱分解情況，產率較低，不適宜大規模生產。

1.2.7　分餾法

分餾法是采用多次蒸餾的方法對沸點相近的混合物進行分離和提純的方法。兩種液態物質沸點相差100℃以上時，可用反復蒸餾法將其分開；沸點相差25℃以下時，用蒸餾的方法則難以達到分離目的，需用分餾柱；沸點相差越小，則需要的分餾裝置越精細。

（1）原理

分餾的原理跟蒸餾基本相同，也是加熱使混合液體汽化冷凝的連續操作過程。比常規蒸餾裝置中增加一個分餾柱（工業上稱為分餾塔盤），被加熱的混合蒸氣進入分餾柱，與內壁上已冷凝（空氣冷卻）回流液體發生對流而交換熱量，使其中沸點較高的成分放熱被液化，回流液體中沸點較低的成分吸熱又汽化。在這種反復液化與汽化過程，沸點較低的蒸氣成分上升進入冷凝器（水冷卻）液化而分離出來。

（2）分餾裝置

分餾裝置見圖1.8，其中分餾柱的作用是增加上升蒸氣在到達冷凝管以前與回流冷凝液的接觸面積，以進行充分的熱交換，在分餾柱內可裝入特制的填料以提高分餾效率。實驗室常用的分餾裝置見圖1.8（a），有刺形分餾柱和填料分餾住。工業上應用的分餾裝置見圖1.8（b），應用的分餾柱塔有板式和填料式兩種。