第二節　纖維SPME理論

纖維SPME技術可用于測定氣體、液體、固體樣品中的目標化合物，操作中涉及纖維的涂層，樣品的基體以及樣品的頂空氣相，是一個復雜的多相平衡過程。萃取開始時分析物吸附在涂層與樣品基體的交界面上，然后再大量擴散到涂層中。如果分析物在固定相中的擴散系數很高，萃取就以吸收的方式進行，分析物可以在兩相之間完全分開。如果擴散系數較低，分析物將以吸附的方式附著在涂層表面。

一、纖維SPME的基本原理與數學模型

如果使用液態聚合物涂層，當單組分單相體系達到平衡時，涂層上富集的待測物的量與樣品中待測物濃度線性相關［12］。在理想的情況下：①化合物只通過擴散方式從液體樣品向固定相遷移；②化合物從溶液向固定相的遷移無需其他能量；③化合物在樣品中的濃度對纖維固定相的物理性質沒有影響。可以得到以下數學公式：

n=KfsVfc0Vs/（KfsVf+Vs）　　（3-1）

式中，n為萃取涂層上吸附的待測物數量；Vf、Vs分別為涂層和樣品的體積；Kfs是待測物在涂層與樣品間的分配系數；c0為待測物的初始濃度。

根據這一理論模型，在混合均勻的樣品中，就只考慮化合物向固定相的擴散，而無須考慮化合物在溶液中的擴散過程。萃取量不僅與化合物在固定相中的擴散系數成比例，還與固定相的體積成比例。而對于不能很好混合的液體樣品，化合物在液相中的擴散必須加以考慮。實驗證明，混合均一的溶液實際上很難得到，因為化合物在纖維周圍的擴散要通過一個穩定的薄液層，因此實際的操作時間往往要比預期的還要長。

若萃取涂層對有機化合物的親和力較強，那么待測物的Kfs值就很大，也就是說SPME能有效富集化合物并具有較高的靈敏度。當Kfs足夠大（KfsVf?Vs）時，纖維的萃取量為：n=c0Vs，可達到完全萃取。但在多數情況下，Kfs值較小，不能達到完全萃取，但經過適當的校正，還可用于定量分析。當樣品體積Vs?KfsVf時，式（3-1）可簡化為：

n=KfsVfc0　　（3-2）

此時涂層上分析物的吸附量直接與基體中分析物的濃度成比例，而與樣品的體積無關，這為SPME的野外采樣提供了依據，即可用萃取頭直接在環境中采集樣品，所以沒必要在分析前選擇限定的樣品。將纖維暴露在大氣中或浸入湖泊、河流中，萃取結束后再把纖維帶回實驗室進行分離測定。為避免途中的樣品損失，可用橡膠塞堵住萃取頭的針頭，或將萃取頭冷凍起來。如此簡化采樣步驟，整個分析過程可以大大加快，也可以防止樣品的分解和一般采樣容器內壁對分析物的吸附所引起的誤差。

另外，由于纖維固定相的體積相對較小（小于0.66μL），一次萃取操作的提取水平很低，如對于血樣中的有機磷農藥萃取量僅為總量的0.03％～10.6％［13］，而對于苯系物（BTEX，苯、甲苯、乙基苯、二甲苯）提取水平在1％～20％之間［14］，所以萃取過程基本不改變樣本基體的狀況，因此十分適合進行活體分析［15］。

對于非活體測定過程中擴散系數較小的目標化合物，若要增加萃取率，可以用纖維對同一樣品反復進行萃取和解吸操作，并通過降低分析柱的溫度至低于分析物的沸點，而使分析物保留在柱頭，當然，這會令分析時間成倍增加。多次萃取得到的萃取量可用下式計算，其中i為測定的次數：

　　 （3-3） 　　

若以F表示多次萃取的全程回收率，也可以在預定回收率F的情況下，計算萃取所需的次數j，如公式（3-4）所示：

j=lg（1/F）/lg（KfsVf/Vs+1）　　（3-4）

對于包括固定相、頂空氣相和液體樣品三相同時存在的頂空萃取體系，萃取時質量傳遞的動力學過程包括了分析物從液相向頂空氣相的遷移以及最終向涂層的遷移，因此相對于上面討論的萃取體系，還要考慮分析物在頂空與液相之間的分配。頂空萃取系統達到平衡后，涂層中待測物的濃度可按下式計算［16］：

n=c0VfVsK1K2/（K1K2Vf+K2Vg+Vs）　　（3-5）

式中，c0為待測物初始濃度；Vf、Vs、Vg分別為涂層、樣品和頂空的體積；K1、K2分別為待測物在涂層與頂空氣相之間的分配系數和在氣液（或氣固）兩相間的分配系數，即涂層、樣品和頂空中分析物的平衡濃度比：K1=。若以K表示涂層與樣品間總的分配系數，那么K=KH/KF=K1K2，其中KF、KH分別為待測物在涂層和樣品基質中的亨利常數。那么式（3-5）就可以寫為：

n=c0VfVsK/（KVf+K2Vg+Vs）　　（3-6）

式（3-6）給出了頂空SPME中，在各相中都達到平衡時聚合物涂層吸附的分析物的量，其中的K值接近于Kow值，而K2=KH/RT，Kow和KH值均可從相關文獻查得，所以從上式就能夠了解頂空SPME法是否適用于待測化合物。對于大多數化合物，K2值都較小，例如苯的K2值只有0.26，所以當頂空氣相的體積遠小于液體樣品的體積（Vg?Vs）時，頂空萃取法測定的檢測限與直接萃取法是相近的。

二、影響萃取效率的因素及提高萃取效率的方法

纖維固相微萃取方法測定樣品時，萃取量不僅取決于纖維涂層的極性和厚度，還與萃取方式、水樣與頂空氣相的體積、萃取時間、攪拌條件、萃取溫度、pH值、無機鹽的濃度和解析條件等諸多因素有關，所以用該方法分析樣品時，必須嚴格控制測定條件，使之與測定校正曲線時完全相同。其中一些參數經過優化，可以有效提高萃取效率。

1.纖維SPME萃取方式的選擇

應用纖維SPME技術萃取目標化合物可以使用3種萃取方式：①直接浸入式萃取（Direct Immersion，DI-SPME）；②頂空萃取（Headspace，HSSPME）；③膜保護萃取，三種萃取方式如圖3-4所示。

直接浸入式萃取是把纖維插入到樣品中，待測物從樣品基體直接遷移到萃取纖維上，適于分析氣體樣品和潔凈水樣中的有機化合物，但不適于復雜樣品基體中有機化合物的分析測定。

目前大部分有機化合物的萃取都選用直接法，尤其是針對水樣中揮發性差的化合物，直接萃取時萃取頭與分析物直接接觸，較頂空法更好。對于氣體樣品，空氣的自然流動可使易揮發的化合物快速達到平衡，但對于液體樣品，纖維涂層外圍會形成一個穩定的薄液層，阻礙目標化合物向涂層的擴散遷移，因此某種形式的攪拌十分必要。應用直接萃取法測定液體樣品的缺點是纖維與樣品基質的接觸會大大縮短纖維的使用壽命。

頂空萃取是將纖維暴露于密封樣品上方的氣相中，萃取揮發到固體或液體樣品頂空中的待測物，適用于分析廢水、油脂、腐殖酸等復雜基體的樣品和固體樣品中揮發、半揮發性有機化合物。相對于直接萃取法，頂空法對擴散系數較大的揮發性物質，更具有優勢。因為部分待測物在萃取之前就已進入頂空氣相；在這里，待測物的擴散系數比在液相中高4個數量級［16］，通過機械方法不斷更新氣液兩相的界面，能夠使分析物更有效地吸附到纖維上，因此大大縮短了平衡所需時間。例如，對于水中的BTEX，取樣時間可從直接法的5min縮短到頂空法的1min，檢測限達到10-9級。另外，頂空萃取法中，纖維不直接接觸樣品，避免了基質的干擾，方法的重現性也優于直接法。

作為最常用的兩種萃取方式，選擇頂空法還是直接法，對方法的靈敏度沒有影響，而是要根據目標化合物的性質確定。因為對于由液體及其頂空氣相組成的體系，纖維萃取的待測物數量與樣品中化合物的濃度密切相關，無論纖維是在液體還是在氣體中，都與纖維所在的位置無關。只有當直接法用于萃取極易揮發的化合物，而該體系又沒有頂空氣相時，其靈敏度才和頂空萃取不同［17］。

膜保護萃取適用于污染嚴重的水樣。纖維通過一個選擇性的膜與樣品隔離。待測物可以通過選擇性膜吸附到纖維上，而樣品中高分子量的化合物不能通過，從而排除基體干擾。與頂空萃取不同的是，膜保護法可用于不易揮發性化合物的分析。但由于待測物先要擴散穿過膜，才能吸附到涂層上，所以萃取時間較長。為縮短萃取時間可以使用較薄的膜和升高樣品溫度。

2.纖維涂層的選擇

纖維涂層的性質直接影響萃取的效率和選擇性。萃取時，選用涂有何種固定相的萃取纖維，應當綜合考慮分析組分的極性、沸點及其在各相中的分配系數，但最基本的依據是“相似相溶”的原則。在現有的商品化纖維中，涂有聚二甲基硅氧烷（PDMS）非極性涂層的纖維，因其涂層面積較大，能耐受300℃的進樣口溫度，應用最為廣泛，對許多非極性和弱極性的化合物均具有很好的萃取效率［18，19］。而涂有聚丙烯酸酯（PA）極性涂層的纖維，多應用于極性化合物如酚類、醇類的分析，但由于化合物在PA涂層中的擴散系數小于PDMS涂層，所需的萃取時間也比較長［20，21］。其他幾種復合涂層中兩種固定相的性質互補，分配系數明顯大于單純的PDMS涂層。帶有二乙烯基苯（DVB）的復合涂層含有很多微孔，使固定相上的吸附和分配作用相互加強，大大增加了萃取的容量，同時這種微孔結構可從一定程度上對分析物的分子量進行識別，增強了纖維的選擇性，PDMS/DVB，CAR/DVB，CW/DVB多用于萃取低分子量的揮發性化合物和極性化合物。兩性涂層PDMS/CAR則是為了分析高揮發性的溶劑和氣體設計的，它比PDMS涂層的纖維表現出更好的萃取效率，但重現性較差，所需平衡時間也較長。

此外，涂層的厚度對萃取的效率和萃取所需的時間也有一定的影響。從SPME的原理可知，增加涂層的厚度可以增大石英纖維涂層的體積，提高吸附量、降低檢測限，但厚的涂層在萃取過程中需要較長的平衡時間。不同厚度的涂層適用的分析對象也不同，薄的涂層適合于萃取分子量大或半揮發性物質，而厚的涂層則適于易揮發性和分子量小的化合物。表3-2中比較了不同厚度的PDMS涂層對不同分子量的化合物的回收率，從中可以清楚地看出這一趨勢。商品化纖維的涂層，性質較為穩定，厚度也能很好地加以控制，具有良好的重現性和重復性，同一根纖維測定化合物的相對標準偏差范圍在3％～9％之間［22］。對于具有同一涂層類型的纖維，萃取的重復性與固定相的厚度有關，一般涂層厚的纖維，重復性比較好。

在與液相色譜聯用的分析中，纖維的選擇還要考慮更多的問題，例如解吸采用的模式，在此過程中流速的改變以及涂層在流動相中的溶脹性等。因此，可用于液相色譜分析的萃取纖維種類比可用于氣相色譜的少得多，只有5種。

3.試樣量、容器體積和頂空體積的選擇

為保證萃取的效果需要對試樣量、試樣容器的體積進行選擇，從SPME的原理可知，纖維萃取量增加不能單純依靠樣品體積的增加。樣品濃度低時，平衡與濃度無關，因此樣品體積的增加對提高萃取量沒有幫助；樣品濃度高時，體積的變化對萃取量就有很大的影響。高濃度的樣品，在萃取之后，試樣中分析物的減少不足以改變基體的濃度，其校正曲線往往呈現指數關系，而低濃度的樣品，校正曲線則呈線性關系，利于測定的進行，所以在樣品濃度范圍未知的情況下，應盡量少地取用試樣。若用直接法測定，還應使體系的頂空體積最小［24］。

對于頂空萃取法，分析的靈敏度還與樣品體積和頂空體積之間的相互關系有關。Denis在利用頂空法檢測14種半揮發性有機氯農藥的研究中指出，試樣量與容器體積之間存在匹配關系，試樣量增大，重現性明顯變好，檢出量也提高了［25］。但我們的頂空萃取實驗表明，當萃取容器體積一定時，同一濃度的樣品體積增加，會使相應的頂空體積減小，纖維的萃取量隨著頂空體積與樣品體積比例的減少呈現先增加后降低的趨勢，也就是說，頂空萃取時存在一個適宜的頂空-樣品體積比。

4.反應溫度的影響

SPME萃取過程中，分配系數與溫度密切相關。應用一般的加熱方式或微波加熱方式［26］適當升高液體樣品的溫度，可加快分子運動速度，從而加快分析物的擴散速度，有利于分析物向纖維涂層的遷移，并可大大縮短萃取相與水相之間平衡的時間。特別是對于頂空SPME法，溫度的升高，不僅能使待測物分子在水相中的運動速率加快，提高其揮發度，促進分析物向頂空氣相的遷移，還能增加氣相的蒸氣壓，加快氣相中分子的碰撞速度，尤其能使固體試樣中的組分盡快釋放出來，提高分析的靈敏度。

但纖維的吸附又是一個放熱過程，過高的溫度會使待測組分在涂層與頂空間的分配系數下降，導致涂層對分析物的吸附能力降低，從而直接引起檢測靈敏度的下降［27］。而且在頂空實驗中我們還發現，水樣溫度升高后，水分子也會揮發到氣相中并在溫度較低的氣相中凝結，形成小水滴附著在纖維上，影響后續的色譜分析。文獻報道，氣相中的相對濕度達到90％時，可使化合物的吸附量減少10％［28］。所以，在實際操作中往往需要選擇一個最佳萃取溫度。尤其是進行多組分同時測定時，由于各化合物的極性和揮發性的不同，所需的最佳溫度也會有所差異，這就要依靠溫度-萃取量的關系曲線來進行選擇。

為了提高萃取效率，有科研工作者曾對SPME的裝置進行了改造，在纖維外側再加一層套管，管內通過液態CO2降低涂層的溫度，使通過高溫手段促使氣相中分析物濃度加大的同時，不影響涂層的吸附能力［29］，取得了良好的分析結果。

對有些試樣如土壤樣品，由于分析組分與基質之間的結合力非常強，單純升高溫度并不能有效地釋放分析組分，需要多種手段綜合使用，提高檢測靈敏度。

5.體系鹽度的影響

向液體樣品中加入無機鹽（NaCl、Na2SO4）可增加溶液離子強度，降低有機物的溶解度，即鹽析作用，使纖維涂層能吸附更多的分析組分，提高萃取效率［30］。但加入無機鹽的量需要根據具體試樣和分析組分來定，如Boyd-Boland在對22種含氮殺蟲劑檢驗中發現，在基體中加入氯化鈉可使多數組分的萃取效率明顯提高，但對惡草靈、乙氧氟甲草醚等農藥卻無效［20］。另外，對有些化合物，當體系鹽濃度過高時，鹽溶作用會占有優勢，此時纖維的萃取量反而減少了。

值得注意的是，樣品溶液中加入鹽，再用纖維直接萃取，測定后需仔細清洗纖維，因為纖維浸過鹽溶液后變脆，極易折斷。

6.體系酸度的影響

由于涂層固定相屬于非離子型聚合物，對于吸附中性物質更有效。所以為了防止液體試樣中待測物質的離子化，提高被吸附的能力，還需要調節溶液的pH值，以改變分析組分與樣品介質、固定相之間的分配系數。尤其是對弱酸性和弱堿性化合物，樣品的pH值直接影響其存在形態，因此應用適當的緩沖溶液調節pH值十分必要。在酸度調節時還應注意到pH對纖維的影響，在pH<1時，PA涂層不穩定。

7.加入溶劑的影響

向液體樣品中加入溶劑會減少纖維上萃取的分析物的量［22，31］，但向固體或污水樣品中加入有機溶劑，可以加速分析物向纖維涂層的擴散遷移［4］，從而提高萃取的化合物的量。適量的水或其他表面活性物質也將有助于固體樣品中結合力強的分析組分的釋放［32，33］。

8.基體攪動狀態與萃取的時間

樣品中分析物的萃取速度由其向涂層的質量傳遞決定，這個過程包括目標化合物在氣體或液體樣品中的對流遷移，以及樣品中存在顆粒物時，分析物從固體表面的解析，和分析物在涂層中的擴散。當質量傳遞只取決于分析物在涂層中的擴散時，薄薄的涂層可使萃取過程很快達到平衡，通常小于1min［14］。但這種理想狀態只能在氣體樣品的分析中才能得到。對于液體樣品，分析物在遷移到纖維涂層上之前，必須通過液體樣品與涂層之間形成的一個穩定的薄液層，因此延長了萃取所需的時間。薄液層很難消除，只有通過強烈而有效的攪拌才能促使擴散慢的化合物加速穿過，遷移到更接近纖維的地方，減弱其造成的干擾。而且通過攪拌還可使水樣中的有機物分子分布更為均一，更快達到分配平衡，提高萃取效率。

一般可采用的攪拌技術有：樣品的快速流動、纖維或容器的快速移動、攪拌或者超聲振蕩等。使用超聲頭對樣品進行超聲振蕩較一般的磁力攪拌更有助于分析組分吸附到纖維上，所需的萃取時間更短。但由于磁力攪拌所用設備簡單，目前的分析仍多使用此法。

為保證試驗結果重現性良好，試驗中應保持萃取時間一定，即從纖維一暴露在樣品中，到萃取過程結束所需要的時間應在多次測定中保持一致。由于平衡時間與眾多因素有關，因此實際萃取時間可由萃取量隨萃取時間的變化曲線來選擇。萃取開始時，待測組分很容易而且很快富集到纖維涂層中，使纖維的吸附量迅速增加，接近平衡時，吸附量變化趨于平緩，此時再延長萃取時間對富集也毫無意義了。擁有這種變化趨勢的化合物，只要在其萃取平衡的時段內，對萃取時間的控制要求并不十分嚴格。多數化合物的萃取時間應控制在5～60min以內，頂空萃取所需時間比直接萃取少，幾分鐘即可使萃取量與原始濃度的比值達到最大。而直接萃取，特別是某些極性分子（如脂肪酸、農藥等）與水分子作用力較強，在水中擴散較慢，萃取時間多為30min以上。

對萃取時間很長或本來就是一個非平衡態的反應體系，其萃取時間很難確定。根據非平衡理論［11］，萃取到纖維上的化合物量可用式（3-7）計算：

　　 （3-7） 　　

式中，K為分析物在樣品和涂層之間的平衡常數；A為涂層的表面積；m1、m2分別為分析物在樣品和固定相中的質量轉移系數。

從式（3-7）以及前文的平衡理論可知，即使未達到平衡，纖維萃取的化合物量與其在樣品中的濃度也存在比例關系，因此并不一定要選擇達到完全平衡的狀態，只要在確定萃取時間之后，嚴格控制萃取時間并使每次測定均保持一致，即可確保測定的精密度。

9.解吸條件

現代的氣相色譜都允許SPME直接進樣并完成熱解吸，由于無溶劑使用，進樣口通常設為不分流方式，并使載氣保持較高的線性流速，這可防止峰展寬。此外有效的熱解吸還取決于化合物的揮發性、涂層的厚度、進樣的深度、進樣口溫度和解吸的時間。

調節進樣口的溫度可以明顯促進解吸效率的提高。而且，適當的解吸溫度還可使測定后纖維上的殘留物最少，殘留主要歸因于雜質與聚合物涂層的強親和力。有研究人員注意到SPME纖維上的殘留就是由于解吸不完全所致［34］。多數化合物的解吸溫度設置在150～250℃之間，往往稍高于它的沸點，目的是保持分析物的熱穩定性，并在此前提下達到完全解吸。對難解吸的化合物，解吸溫度要求更高，如農藥需要300℃的高溫才能有效解吸。對含有高溫易分解化合物樣品，可在進樣口采用程序升溫的方式。例如水中碘化合物的測定，因為溫度大于150℃時CHI3會分解，所以進樣口采用升溫速度為5℃/min的方式從120℃→200℃或25℃/min的速度從150℃→200℃解析分析物，既可保證CHI3不發生熱解，又可保證其他極性分析物的正常解吸［35］。為了進一步加快分析速度，還可應用其他解吸方式，如使用由熱脈沖加熱而非持續加熱的汽化室，使用裝有內熱裝置的萃取纖維，以及利用金屬作萃取纖維通過加電壓后的瞬時短路來高溫解吸或使用激光脈沖加熱解吸［36］等。

纖維插入進樣口的深度對解吸的效率和柱分離的效果也有巨大影響。在分析過程中GC的進樣口溫度與柱溫是不同的，致使進樣口內存在溫度差異，所以纖維插入的深度應調節到進樣口的高溫區或中心處。如果纖維在進樣口中的位置溫度較低，目標化合物的解吸速度慢，使進入分離柱的樣品分子分散，就會造成色譜峰變寬，如圖3-5所示。因此纖維插入進樣口的位置也要經過優化實驗加以確定。

纖維還需在進樣口中停留一段時間，使分析物完全解吸下來，解吸的難易程度取決于分析物與纖維涂層的作用力大小和進樣口的溫度。一般2～5min即可使分析物完全解吸。實際上，許多揮發性化合物的解吸只需要1s，稍長的時間設置是為了去除纖維的殘留。

用SPME-HPLC接口解吸可以采用兩種方式：動態解吸和靜態解吸。動態解吸中，纖維先插入接口，六通閥扳至“Injection”位置，化合物即被流動相沖洗下來，并直接進入色譜柱進行分離；靜態解吸多用于牢固吸附在纖維上難以解吸的化合物，即先在接口中充滿流動相或其他解吸溶劑，再將纖維插入接口浸泡一段時間，使化合物解吸進入溶劑中，再將六通閥扳至“Injection”位置，使分析物和溶劑進柱分離。無論使用哪種方式，使用最少量的溶劑對優化條件十分重要。

10.衍生化反應

針對強極性、難揮發的化合物，可使用衍生的方法，增加揮發性，降低極性，使其更易被固定相吸附，這樣可有效增加萃取的效率、選擇性，也利于后續的色譜分析，已經有很多化合物的測定中使用了衍生反應［37～39］。固相微萃取中普遍使用的有三種衍生方式，即原位衍生法、纖維上衍生法和進樣口內衍生法。原位衍生法是指將衍生試劑加入待測樣品中進行衍生反應，之后再用SPME纖維萃取衍生產物。這一方法已經用于水中苯酚的測定，通過衍生反應將其轉變為醋酸鹽可得到滿意的結果［6］。

纖維上衍生又有兩種方式。其一是將衍生用于萃取過程之后，即先將纖維暴露在樣品或樣品頂空中萃取分析物，再將吸附了分析物的纖維暴露在衍生試劑中一段時間，使分析物轉變為相應的衍生產物。Okeyo等用85μm PA纖維，于室溫下頂空萃取血清中的類固醇，30min后，再將纖維暴露于純的衍生試劑（BSTFA）蒸氣中，60℃頂空衍生1h，成功地萃取分離了六種類固醇［40］。另一種則是將衍生用于萃取過程之前，即將萃取纖維浸入衍生試劑中，待涂層中吸附了一定量的衍生試劑后再進行SPME萃取，這時在纖維涂層上萃取過程和衍生化反應同時進行。由于分析物一旦被萃取，就會發生衍生反應，所以這并非一平衡過程。由于此方法具有較高的萃取效率，易于進行現場采樣分析，最具發展潛力，但對揮發性低的化合物具有一定的局限性。有人用溴化五氟苯甲烷或重氮化五氟苯乙烷對短鏈脂肪酸進行纖維上衍生化，用季銨堿和季銨鹽對長鏈脂肪酸進行衍生化，頂空SPME法測定了水樣和糞便中的脂肪酸［41，42］。

SPME纖維萃取化合物之后進入色譜儀，也可以在進樣口內進行衍生反應。Nagasawa［43］等用此方法測定了安非他明，在SPME萃取后，通過向進樣口注入衍生試劑，使之轉化為氨基衍生產物，得以測定。