京都的大閱兵式結束之后，信長就開始對各地戰局進行了分析。北國方面，負責鎮守越中國的上杉家武將河田長親病逝，柴田勝家趁機進軍，已經奪取了越中國大半地盤，又有丹羽長秀從北近江接應，形勢大好。對武田方面，德川家康也主動出擊奪回了遠江國的高天神城。至于紀伊國的雜賀黨，首領雜賀孫一(鈴木重秀)已經在羽柴秀吉的調略下傾向信長，但是和反信長派的土橋平次展開火拼，勢力大不如從前。毛利方面，由于得到了宇喜多直家的支持，羽柴秀吉也一路順利，向著備中國進軍了。外部形勢可謂一片大好，但是內部地區的危機不可不防。之前曾打敗織田信雄的伊賀忍軍，以及逃跑了的荒木村重，都成為了信長心中的不安因素。

1581年1月，負責調查荒木村重行蹤的松井友閑來報，高野山的和尚藏匿荒木村重殘黨，暗通足利義昭，大有謀反之意。信長派使者去高野山調查，但全部被殺。信長大怒命松井友閑抓捕主持高野圣，并將其殺害。聽聞高野圣主持被害，寺內僧眾聯合根來寺開始進行反信長活動。信長命一族的岸和田城城主織田信張為總大將進攻高野山。1月30日，織田信張逮捕了1383名高野山僧人，并在京都七條河原斬首示眾。10月2日，信長又派遣堀秀政作為援軍進攻根來寺，俘虜了350名僧人，也全部殺害。10月5日，筒井順慶也率兵前來相助，三人向高野山發起了總攻擊。但是，高野山易守難攻，加上山上的僧兵果敢應戰，雙方均死傷慘重，戰事陷入了膠著狀態。直到后來的1582年，信長開始甲州征伐，高野山的攻勢才得以緩和。1582年8月，信長又改命織田信孝為總大將進攻高野山，俘虜殺害高僧131名，但是直到信長死亡，也沒能攻下此山。

1581年4月，伊賀國柘植鄉豪強福地宗隆和河合村村長耳須彌次郎來安土城拜望信長，并提出愿做向導帶領織田軍攻克伊賀國。信長遂命織田信雄為總大將，起兵5萬兵分5路再攻伊賀國，自己坐鎮安土城，親自指揮。參戰武將包括織田信雄、織田信澄、瀧川一益、丹羽長秀、蒲生氏鄉、筒井順慶、筒井定次、脅坂安治、不破光治、淺野長政、堀秀政、瀧川雄利，大有不滅伊賀不復還的架勢。

伊賀十二人眾的筆頭百田藤兵衛，召集瀧野吉政、町井清兵衛、森田浄云、百地丹波、初代服部半藏（德川家服部半藏之父）等人在平樂寺商議對策。眾人明知打不過織田軍，但又覺得投降有辱家名，決心拼死一戰。當晚，無論家中男女老幼都一起積極備戰，搬運石材修筑比自山城。

織田信雄與瀧川雄利從伊勢國向東進軍，占領東禪寺作為據點，分三路進軍：瀧川雄利3000人，日置大膳亮3000人，信雄自己帶領4000人。一路燒毀了久昌寺、極樂寺、大村神社、豬田神社等據點，瀧川雄利偷偷運走了極樂寺的佛像，以免被戰火涂炭。之后，三人又攻破了小波田堡壘，向比自山進軍。

丹羽長秀和瀧川一益由福地宗隆帶領，進入了在伊賀國唯一有石垣的城堡福地氏城，隨即攻入柘植鄉，僅僅半日，就占領了該地。柘植豪族害怕織田軍勢，紛紛逃入山中。兩人又命手下士兵假冒敗逃的敵兵詐開了柏野城大門，一舉奪城。后來又奉信長之命，在伊賀國的鐵炮產地和物資屯放地長橋寺進行激戰，并燒毀該寺。本來一切順利，但是在由百地丹波把守的堡壘受阻。百地丹波的出身可不一般，百地氏與藤林長門守的藤林氏、服部半藏的服部氏齊名，統稱“伊賀上忍三家”。后來，豐臣秀吉時代的大盜石川五右衛門，相傳就是百地丹波的弟子。丹羽和瀧川見此路難行，只能從大山田繞道，差點沒趕上比自山城的總攻。

蒲生氏鄉和脅坂安治由耳須彌次郎帶領，從南近江出發，率兵7000攻入伊賀。兩人在玉瀧寺扎營，與鎮守雨晴山城的藤林長門守激烈交戰。直至日落，城內的彈藥和弓箭都已經射完，城池陷落，藤林長門守下落不明。當天夜里，負責帶路的耳須彌次郎，被人暗殺，兇手正是藤林氏的忍者與助和左八。兩人率兵行至佐那具，氏鄉于扎營后召開酒宴慶祝，但晚間遭到了伊賀忍軍的奇襲，織田軍大敗，連退20余里。蒲生氏鄉大怒，次日就率兵進攻平樂寺，由于當地豪族都逃往比自山城，防守寺院的只有少數僧兵，抵抗不足半日就讓織田軍殺了進去。蒲生氏鄉下令，不論那男女老幼，一個不留。之后，蒲生和脇坂又在一座山寨遭遇了町井左馬充夫婦。町井左馬充之妻阿清，善用薙刀，武藝超群，斬殺了多名織田士兵。最后夫妻二人力盡而死。蒲生氏鄉稱贊阿清為“伊賀國之花”，并下令厚葬兩人。

堀秀政在甲賀忍者多羅尾光弘的帶領下，率兵2300人從信樂口出發進攻伊賀。兵至島原，當地豪族并不愿意與織田家交戰，相反的尋求織田家的庇護。堀秀政嚴令軍紀并通過光弘與他們見面商談。共有16名當地代表來到陣中，并說道：“將軍，我等無意與織田家交戰，只有一事相求。此地的觀菩提寺是受圣武天皇敕命于730年所建，周圍還有十二僧坊和其他著名的寺院。希望將軍不要像其他進攻伊賀國的織田軍一樣燒毀這些寺院，要不我們將沒有顏面面對先祖。”堀秀政答應了下來，在島原一把火沒放就向著西山鄉進兵了。但很快就遭到了信長訓斥，命其必須燒毀沿途的各種神社、寺院。進入西山后堀秀政不得不遵從信長的命令開始放火。在高倉神社時還留下了一個傳說：織田軍在放火之際，突然出現了一個孩子，忽悠忽悠的飄在空中，并使用法力滅火。他只要伸出雙手，前方的燃燃大火就會瞬間消失殆盡。負責放火的武士林三郎，一個飛斧過去想要砍死小孩，誰知斧子在碰到小孩身體的一剎那就反奔自己而來。斧子直接貫穿林三郎的身體釘到了其身后的柱子上，三郎即死。織田軍見到此景無人再敢出手，立刻退散。高倉神社的本殿至今還保存著，邊上還有那根留著斧印的柱子。

筒井順慶、定次父子從大和國向伊賀進軍，共計3700人。沿路燒毀村莊，但并沒有見到多少抵抗。村人都隨瀧野吉政逃往比自山城避難，基本沒有遇到任何戰斗。之后，父子二人又以壓倒的兵力差攻下了菊池丹波守鎮守的城池。菊池逃往比自山城。除丹羽長秀和瀧川一益外，四路大軍已經聚集在比自山城下，攻城戰一觸即發。